Avaliação da Toxicidade de proteínas Cry e Cyt de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis para diferentes linhagens de células de inseto e de mamífero
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012.Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva que produz proteínas formadoras de cristal ou δ-endotoxinas que compreendem as toxinas Cry, com atividade inseticida específica, e Cyt, com atividade citolítica inespecífica. Diferentes δ-endotoxinas mostram-se específicas para diferentes insetos-alvos. Esta especificidade deve-se a receptores de membrana distintos nas células do intestino dos insetos e à presença de diferentes proteases próprias dos insetos, necessárias para ativação proteolítica da prótoxina produzida na fase de esporulação do B. thuringiensis. Os genes cry4Aa, cry11A e cyt2Ba foram amplificados por PCR a partir das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, S-1989 ou S-1806. Os produtos das PCR foram clonados em um vetor de expressão em B. thuringiensis, pSVP27A. O gene cyt2Ba foi também clonado em vetores de transferência para construção de baculovírus recombinantes para expressão da proteína Cyt2Ba nativa ou fusionada à proteína Poliedrina. Estirpes de B. thuringiensis acristalíferas foram usadas para expressão individual das proteínas. Após purificação e solubilização das proteínas heterólogas, as memsmas foram ativadas com tripsina ou suco gástrico de Spodoptera frugiperda, para a realização de ensaios de atividade em culturas de células de Lepidoptera, Diptera e mamífero. Foram usados, nos ensaios de citotoxicidade, 20 μg/mL de cada toxina Cry individual ou em combinações e 20 μg/mL ou 5 μg/mL da toxina Cyt2Ba. Atividades tóxicas das toxinas heterólogas ativadas por tripsina foram detectadas para todas as linhagens de células de insetos testadas, fato que não ocorreu após ativação das mesmas toxinas com suco gástrico de S. frugiperda. Para células humanas, apenas Cyt2Ba mostrou-se tóxica. Entretanto, a combinação entre Cyt2Ba e as toxinas Cry4Aa e Cry11A apresentou citotóxicidade maior que Cyt2Ba isoladamente, o que pode sugerir que Cyt2Ba funcione como receptor para Cry4Aa e Cry11A em células humanas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTBacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium that produces crystal forming proteins, δ-endotoxins, which consist of Cry toxins harboring specific insecticidal activity, and Cyt toxins that contain non-specific cytolytic activity. Different δ-endotoxins are specific to different target insects. This specificity is due to distinct membrane receptors on the surface of the insect´s midgut cells and to the presence of different host´s proteases, which are necessary to proteolytic activation of the protoxin expressed during B. thuringiensis sporulation phase. The cry4Aa, Cry11A and cyt2Ba genes were amplified from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Brazilian strains, S-1989 or S-1806 by PCR. The PCR products were cloned into the B. thuringiensis expression vector, pSVP27A. The cyt2Ba gene was also cloned into transfer vectors to allow construction of recombinant baculoviruses, in order to express the native Cyt2Ba protein, or Cyt2Ba fusioned to the Polyhedrin protein. Acrystaliferous B. thuringiensis strains were used for the expression of the proteins individually. After purification and solubilization of the heterologous proteins, toxin activation by either trypsin or Spodoptera frugiperda´s gastric juice was carried out to perform citotoxicity assays using Lepidopteran, Dipteran and human cultured cells. Each Cry toxin was used at the concentration of 20 μg/mL, while Cyt2Ba was used at two different concentrations: 20 μg/mL or 5 μg/mL. Cytotoxic activities of the trypsin activated heterologous proteins were detected to all insect cell lines tested, but when the same proteins were digested by S. frugiperda´s gastric juice, no toxic activities were detected. Only Cyt2Ba was shown to be toxic to the human cells tested. Nevertheless, the combination of Cyt2Ba and both Cry4Aa and Cry11A toxins yelded a higher toxicity than that produced by Cyt2Ba isolatedly, which could suggest that Cyt2Ba could be functioning as a receptor for Cry4Aa and Cry11A on the surface of human cells
