Salmonella is one of the most commonly reported foodborne pathogens and enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) is one of the most dangerous. They both spread by zoonotic and person-to-person transmission routes. Most Salmonella infections are characterized by mild-to-moderate self-limited diarrhea but also serious disease resulting in death has been reported.Bloody diarrhea is a common symptom of human EHEC infection and the infection may lead to severe post-infection disease such as hemolytic uremic syndrome (HUS), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) and even death.
The purpose of this thesis was to investigate the diversity of Salmonella and EHEC strains isolated from domestically acquired infections using several pheno- and genotyping methods for surveillance and outbreak investigation purposes as well as evaluate certain epidemiological typing methods in Finland. All Salmonella and EHEC isolates of domestic origin during 2007-2014 in Finland were studied. Serotyping, phage typing, antimicrobial susceptibility testing, phenotype microarray, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) were applied as epidemiological typing tools for Salmonella isolates. EHEC isolates were analyzed using serotyping, phage typing, antimicrobial susceptibility testing, virulence gene detection (stx1, stx2, eae, hlyA and saa) and PFGE.
During the study period, the number of domestically acquired Salmonella infections has decreased about one fifth compared to the previous decade whereas the number of domestic EHEC infections have increased about one third.Th e incidence of Salmonella infections was highest in 2012 (7.5/100,000 population) and lowest in 2014 (5.4/100,000 population). The incidence of EHEC infections was highest in 2013 (0.33/100,000 population) and lowest in 2008 (0.07/100,000 population). 15% of all Salmonella strains and 70% of all EHEC strains were considered domestically acquired. A total of 131 different Salmonella serovars were detected. The most common serovars were Typhimurium (32%), Enteritidis (15%) and group B (6%). Among Typhimurium strains, phage types DT1 (37%), RDNC (18%) and DT104 (9%) were the most common ones. The most frequently detected phage types among the domestically acquired S. Enteritidis infections were PT8 (17%), PT1B (14%) and PT4 (13%). Th e majority of domestic Typhimurium and Enteritidis (60%) strains were susceptible to tested antimicrobials. During the study period, a total of 188 infections caused by EHEC were detected. Most of them were caused by serotype O157:H7 (60%). The majority of O157 strains (63%) were unable to ferment sorbitol. PT8 was the most common phage type among the sorbitol-negative and PT88 among sorbitol positive O157 strains. Among non-O157, 22 distinct O:H serotypes were detected. The most common ones were O26:H11, O103:H2 and O145:H-. The majority of domestic EHEC strains (81%) were susceptible to all tested antimicrobials: 96% of O157:H7/H- and 60% of non-O157 strains. All O157 strains carried stx2 (40% in combination with stx1), eae and hlyA genes. In contrast, 55% of non-O157 stains had stx1 gene and 76% carried eae and hlyA genes.
The MLVA method was found to be a powerful epidemiological tool for S. Typhimurium with discriminatory power similar to PFGE. In addition, MLVA was faster, cheaper and the results were easier to compare between laboratories. The domestic S. Typhimurium strains were divided into 170 distinct MLVA types (diversity index 0.891). In MLVA, the three most common profiles (3-16-NA-NA-0311, 3-15-NA-NA-0311 and 3-17-NA-NA-0311) counted for 47% of the strains showing that the lack of locus STTR6 and locus STTR10p was characteristic for domestic S. Typhimurium. However, XbaI-PFGE remains a useful genotyping method for investigations of other Salmonella serovars and EHEC strains. The interpretation of XbaI-PFGE profiles can be challenging as demonstrated by a Finnish nationwide outbreak caused by S. Newport and S. Reading -contaminated iceberg lettuce. The S. Reading strains had four diff erent XbaI-PFGE profiles. Based on epidemiological information, all these different variants of the outbreak causing strains were considered as outbreak-related.
The sources of the most EHEC outbreaks remained undetermined. In one out four EHEC O157 outbreaks, unpasteurized milk was found as the source of the infections. Although 40% of the domestic EHEC strains were non-O157, only strains of serogroup O157 caused outbreaks in Finland. However, non-O157 strains caused several family clusters and were linked with HUS. In 2009, a sorbitol-fermenting EHEC O78:H-:stx1c:hlyA was detected in blood and fecal samples of a neonate. This EHEC serotype had not been seen in Finland prior to this family-related outbreak and bacteremia caused by EHEC is exceptionally rare.
Taken together, Salmonella and EHEC infections are a major public health concern. This thesis provides new information about the characteristics of Salmonella and EHEC strains isolated from domestically acquired infections in Finland and evidence that effective surveillance is needed for early detection and prevention of the spread of Salmonella and EHEC infections. In particular, typing methods used should be internationally harmonized and the results made comparable.Salmonella on yksi yleisimmistä elintarvikevälitteisistä bakteeripatogeeneistä, enterohemorraaginen Escherichia coli (EHEC) yksi vaarallisimmista. Molemmat bakteerit ovat eläimen ja ihmisen välityksellä leviäviä ja tarttuvat myös henkilöstä toiseen. Useimmat salmonellojen aiheuttamat infektiot ovat lieviä, itsestään parantuvia suolistoinfektioita, mutta myös vakavia, kuolemaan johtavia tartuntoja todetaan. Veriripuli on yleinen oire erityisesti pikkulasten EHEC-infektiossa. Infektio saattaa johtaa myös vakaviin jälkitauteihin kuten hemolyyttisureemiseen oireyhtymään (HUS), tromboottiseen trombosytopeeniseen purppuraan (TTP) ja jopa kuolemaan.
Tässä työssä tutkittiin salmonella- ja EHEC-kantojen ominaisuuksia useilla ilmiasuun (fenotyyppi) ja perimään (genotyyppi) perustuvilla menetelmillä. Lisäksi selvitettiin tiettyjen genotyypitysmenetelmien soveltuvuutta epidemiologiseen seurantaan ja tartuntalähteiden jäljittämiseen. Erityisesti oltiin kiinnostuneita niistä salmonella- ja EHEC-kannoista, joiden tartunta oli saatu Suomessa. Tutkimus käsitti kaikki kotimaiset vuosina 2007-2014 eristetyt salmonella- ja EHEC-kannat. Salmonella-kantojen epidemiologiseen tyypittämiseen käytettiin neljää fenotyypitysmenetelmää, serotyypitystä, faagityypitystä, mikrobilääkeherkkyysmääritystä ja mikroarray testiä sekä kahta genotyypitysmenetelmää, pulssikenttägeelielektroforeesiä (PFGE) ja multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) testiä. EHEC-kantojen tyypitykseen käytettiin O:H-serotyypitystä, faagityypitystä, mikrobilääkeherkkyysmääritystä, virulenssigeenien määritystä (stx1, stx2, eae, hlyA and saa) ja PFGE -menetelmää.
Tutkimusaikavälillä kotimaassa saatujen salmonellainfektioiden määrä laski noin viidenneksen verrattuna edelliseen vuosikymmeneen kun taas EHEC tartuntojen lukumäärä nousi noin kolmanneksen. Kotimaisten salmonellatartuntojen ilmaantuvuus oli korkeimmillaan vuonna 2012 (7.5/100 000 asukasta) ja alimmillaan vuonna 2014 (5.4/100 000 asukasta). Kotimaisten EHECinfektioiden ilmaantuvuus oli korkein vuonna 2013 (0.33/100 000 asukasta) ja matalin vuonna 2008 (0.07/100 000 asukasta). Kaikista salmonellatartunnoista 15 % ja EHEC-tartunnoista 70 % oli kotimaista alkuperää. Kotimaisia salmonellatartuntoja aiheutti yhteensä 131 eri serotyyppiä. Niistä yleisimmät olivat Typhimurium (32 %), Enteritidis (15 %) ja ryhmä B (6 %). Kotimaisten S. Typhimurium -kantojen yleisimmät faagityypit olivat FT1 (37 %), NST (18 %) ja FT104 (9 %). Kotimaista alkuperää olevien S. Enteritidis -kantojen yleisimmät faagityypit olivat FT8 (17 %), FT1B (14 %) ja FT4 (13 %). Suurin osa kotimaisista Typhimurium- (60 %) ja Enteritidiskannoista (60 %) olivat herkkiä testatuille mikrobilääkkeille. Tutkimusaikavälillä todettiin 188 EHEC-tartuntaa, joista valtaosan aiheutti serotyyppi O157:H7 (60 %). Suurin osa EHEC O157 -kannoista (63 %) oli sorbitoli-negatiivisia. Faagityyppi FT8 oli yleisin sorbitoli-negatiivisten ja faagityyppi FT88 sorbitoli-positiivisten O157 kantojen keskuudessa. Non-O157 kannat tyypittyivät yhteensä 22 eri O:H serotyyppiin. Yleisimmät non-O157 serotyypit olivat O26:H11, O103:H2 ja O145:H-. Suurin osa kotimaista alkuperää olevista EHEC-kannoista (81 %) oli herkkiä testatuille mikrobilääkkeille: 96 % kaikista O157:H7 ja 60 % non-O157 kannoista. Kaikki O157 -kannat kantoivat geenejä stx2 (40 %:lla kannoista oli myös stx1 geeni), eae ja hlyA kun taas valtaosa non-O157 kannoista kantoi geeniä stx1 (55 %) ja 76 %:lla kannoista oli geenit eae ja hlyA.
MLVA -menetelmä osoittautui toimivaksi epidemiologiseksi tyypitysmenetelmäksi, ja sen erottelukyky oli yhtä hyvä kuin aiemmin käytetyn PFGE -menetelmän. Lisäksi MLVA oli nopeampi ja halvempi kuin PGFE menetelmä ja tulokset olivat helpommin kansainvälisesti vertailtavissa. Kotimaista alkuperää olevat S. Typhimurium -kannat jakaantuivat 170 eri MLVAtyyppiin (diversiteetti-indeksi 0,891). Noin puolet (47 %) kannoista kuului kolmeen yleisimpään MLVA -tyyppiin (3-16-NA-NA-0311, 3-15-NA-NA-0311 ja 3-17-NA-NA-0311). Lokuksien STTR6 ja STTR10p puuttuminen oli tyypillistä kotoperäisille S. Typhimurium -kannoille. XbaI-PFGE oli kuitenkin hyödyllinen menetelmä muiden salmonellan serotyyppien ja EHEC-kantojen genotyypittämiseen. XbaI-PFGE tulosten tulkitseminen saattaa olla haastavaa, minkä myös maanlaajuinen S. Newport/S. Reading -epidemia vuonna 2009 havainnollisti. Kyseisessä epidemiassa S. Reading kannat jakaantuivat neljään eri PFGE -tyyppiin, joiden kuitenkin katsottiin epidemiologiseen tietoon perustuen liittyvän samaan epidemiaan.
Useimpien EHEC-epidemioiden lähteet jäivät tuntemattomiksi. Tutkimusaikavälillä havaittiin neljä EHEC -bakteerin aiheuttamaa epidemiaa ja useita perheensisäisiä rypäitä, joista yhdessä lähteeksi todettiin pastöroimaton maito. Vaikka 40 % kaikista kotoperäisistä EHEC -infektioista oli non-O157 serotyyppien aiheuttamia, vain serotyyppi O157 aiheutti epidemioita Suomessa. Non-O157 kannat aiheuttivat kuitenkin perheensisäisiä tartuntoja ja yhdistettiin vakaviin jälkitauteihin (HUS). Vuonna 2009 sorbitoli-positiivinen EHEC O78:H-:stx1c:hlyA eristettiin vastasyntyneen verestä ja ulosteesta. Kyseistä serotyyppiä ei ollut havaittu Suomessa aikaisemmin ja EHEC -bakteerin aiheuttamat verenmyrkytykset ovat kansainvälisestikin erittäin harvinaisia.
Salmonella ja EHEC aiheuttavat merkittäviä kansanterveysongelmia. Tässä työssä saatiin merkittävää uutta tietoa Suomessa todettujen kotimaista alkuperää olevien salmonella- ja EHEC-infektioiden aiheuttajabakteereiden ominaisuuksista. Tehokas salmonella- ja EHEC-seuranta auttaa havaitsemaan alkavat epidemiat ja estämään niiden leviämisen. Erityisesti uusia tutkimusmenetelmiä kehitettäessä tulisi huomioida, että tyypitysmenetelmä on kansainvälisesti harmonisoitu ja tulokset vertailukelpoisia
