Estudio de la relación funcional entre el tráfico intracelular de LRP1 y la respuesta celular a la insulina

Abstract

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019El LRP1 (low density lipoprotein receptor-related protein 1) es un receptor que se encuentra expresado en diferentes tipos celulares tales como células gliales de Müller y cardiomiocitos. Entre las diversas funciones de este receptor se destaca su capacidad de regular la expresión y actividad de diferentes proteínas en la membrana plasmática, como ser el caso del receptor de insulina (IR). Se ha demostrado que la deficiencia de LRP1 en neuronas y hepatocitos genera resistencia a la insulina. En este sentido, la insulina estimula el tráfico de LRP1 a la superficie celular en adipocitos, hepatocitos y células musculares, aunque se desconoce cómo es la regulación de este tráfico intracelular. Esta movilización de LRP1 hacia la membrana plasmática, a su vez, le permitiría regular la actividad del IR en respuesta a la hormona. Numerosos estudios relacionan la resistencia a la insulina con el incremento de subfracciones aterogénicas de lipoproteínas de baja densidad, como las modificadas por agregación (agLDL). El exceso de estas lipoproteínas es almacenado en diferentes tejidos, como músculo e hígado, contribuyendo con la resistencia a la insulina, aunque el mecanismo a través del cual esto ocurre no es del todo claro. El LRP1 es uno de los receptores involucrados en la captación de colesterol esterificado desde agLDL, lo que podría tener relación con alteración de la respuesta a la insulina. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo del presente trabajo de tesis fue caracterizar la relación funcional entre el tráfico intracelular de LRP1 y la respuesta celular a la insulina. Dentro de este marco general se plantearon los siguientes objetivos específicos: i) Identificar las estructuras vesiculares de almacenamiento de LRP1, así como las proteínas de transporte vesicular y las vías de señalización intracelulares implicadas en el tráfico hacia la membrana plasmatica de este receptor por acción de insulina; y ii) Establecer la participación de LRP1 sobre la respuesta celular a insulina, y cómo este evento es alterado por la presencia de ligandos como las agLDL. 9 Como modelo experimental se utilizaron las líneas celulares: MIO-M1, células gliales de Müller de retinas humanas; y HL-1, cardiomiocitos de ratón. En cuanto al tráfico intracelular de LRP1 inducido por insulina en células MIO-M1, por microscopia confocal se evidenció un incremento significativo de la localización de LRP1 principalmente en endosomas tempranos [EEA1+] y en el compartimento de reciclado rápido [Rab4+] en presencia de insulina. Mediante ensayos de biotinilación de proteínas de superficie celular, se evidenció que insulina promueve la movilización de LRP1 hacia la membrana plasmática en estas células. Este tráfico de LRP1 hacia la membrana plasmática fue mediado por la activación de la vía de señalización intracelular IR/PI3K/Akt, evidenciado mediante ensayos de in cell Western blot. Por microscopia electrónica de trasmisión se pudo identificar vesículas intracelulares de ≈100 nm, que almacenan LRP1 junto con otras proteínas características de estas estructuras como sortilin y VAMP2. Finalmente, insulina promovió el tráfico de LRP1 a la superficie celular a través diferentes vías posibles de reciclado y/o exocitosis, entre ellas, la vía de reciclado rápido [Rab4+] y la vía exocítica mediada por Rab8A y Rab10, como se pudo observar mediante ensayos de biotinilacion de proteínas de superficie celular. En cuanto a la participación de LRP1 sobre la respuesta celular a insulina, y como este evento es afectado por las agLDL en células HL-1, se demostró que el tratamiento con agLDL durante 8 horas produjo una acumulación significativa de colesterol esterificado evidenciada por extracción lipídica y cromatografía en capa delgada. La captación de estas lipoproteínas modificadas fue mediada por LRP1, ya que este efecto fue bloqueado por GST-RAP. Mediante microscopia confocal se evidenció que la interacción entre las agLDL y LRP1 promovió la localización del receptor en compartimentos de degradación del tipo endosomas tardíos o lisosomas, los cuales resultaron ser disfuncionales, y afectó la localización de este receptor en regiones celulares ricas en caveolina por acción de insulina. Mediante ensayos de inmunoprecipitación, se evidenció la alteración de la asociación molecular entre LRP1 e IR. A continuación, mediante Western blot, ensayos de marcación de proteínas de superficie con biotina y microscopia confocal, encontramos que las agLDL afectaron la activación de la cascada de señalización 10 intracelular inducida por insulina lo que resultó en una reducción de la exocitosis hacia la membrana plasmática de GLUT4 y una menor captación de glucosa por acción de insulina en los cardiomiocitos expuestos a agLDL. En conclusión, la insulina regularía el tráfico de LRP1 hacia la membrana plasmática, principalmente desde vesículas intracelulares, a través de la activación de la cascada de señalización intracelular IR/PI3K/Akt, y en parte mediante una ruta de exocitosis regulada por insulina que involucraría la participación de Rab8A y Rab10. Este evento resulta en un aumento de la expresión de LRP1 en la superficie celular, lo cual tendría implicancias en la respuesta celular a la insulina. La presencia de un ligando específico de LRP1 como agLDL alteraría la distribución intracelular de este receptor, afectando la asociación molecular entre LRP1 e IR, la señalización intracelular inducida por insulina y la captación de glucosa extracelular en cardiomiocitos. Estos resultados en su conjunto presentan una nueva perspectiva en el estudio bioquímico y celular de la relación del tráfico intracelular de LRP1 y la respuesta celular a la insulina, lo que podría tener implicancias fisiopatológicas en los procesos de neovascularización y neurodegeneración retinal como así también en la alteración de la función cardíaca que se producen en situaciones de resistencia a la insulina.202