Reynaud, A.

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Especificidad, antibiosensibilidad y virulencia de las cepas de Escherichia coli aislados del ciego del conejo A. Reynaud y col. (Cuni Sciences, 1987, 4 : 1-7) Para conocer la incidencia real de los Es-cf¡ericf¡ia coli, capaces de provocar trastornos diarréicos en los conejos, se ha realizado un estudio sistemático durante muchos meses de todos los conejos llegados al laboratorio, refiriéndose el trabajo a la aparición del E. coli en los ciegos y la investigación de posibles variedades sobre los serogrupos O 103 Y O 132. Han sido realizados antibiogramas de las cepas presumiblemente patógenas para com-parar sus antibiosensibilidades con los resul· tados anteriores. Este balance ha permitido confirmar la es-pecificidad del serogrupo O 103 para el co-nejo. Por otra parte, nosotros hemos cons-tatado la resistencia a las betalactaminas de ciertas cepas, poniendo de manifiesto en ellas de una betalactamasa codificada por genes transportados por un plásmido autotransmisi-ble. El estudio ha demostrado que la diferen-cia entre un E. coli O 103 no patógeno o patógeno, se debe fundamentalmente a un factor de virulencia presente únicamente en las estirpes patógenas. Este factor, permite la colonización e invasión del tubo digestivo por las bacterias que se halla codificado por genes transportados por un plásmido. Material y método Estirpes bacterianas. El estudio de la sen-sibilidad a los antibióticos realizado sobre las diversas cepas de E. coli aisladas a parti r del ciego de conejos vivos se agruparon en dos apartados: ·47 cepas aisladas de 12 conejas y 35 conejos de engorde remitidos al laboratorio desde el 1.° de enero al 31 de jun io de 1987 en que la mayoría de los animales procedían de granjas racionales. -41 cepas de colibacilos O 103, aislados en 1985 Y 1986 en tres centros -el Laboratorio del Departamento de Servicios Veterinarios de Puy de Dllme, el Laboratorio de Patología Médica de Animales de corral, de la Escuela de Vete rinaria de Toulouse y el Laboratorio de Análisis Biológico Veterinario de Herbiers-. Como complemento al estudio de la espec ifi· cidad de los grupos 0103 y 0102 se utilizaron 31 variedades a partir de animales y 16 de origen humano. Tabla 1 Recuento de E col; de 12 conejas procedentes de 9 gran' ¡as Variedad de o a 100.000 UFC/g mas de 100.000 UFC E. coN aislado aglutinante con serogrupo 0103 O 3 E. coli aislado aglutinante con serogrupo 0132 O O E. coN no aglutinantes con 0132 o 0103 9 O 14 febrero 1988 I cunicultura • composición Suspensión del virus vivo de Shope en un medio especial , liof ilizado y cerrado al vacío . ~osificación y vía ~e a~mínislración Ví, lubcuténea: Una dosis en 0.5 mI. Vía in1radérmica (Dermojet) : Una dosis en 0,1 mI. mo~o ~e empleo Oi10lvente vía Disolye nte Dermojet Presentación subcutánea (completo) (la quinta parte ) 10 dosis 5 mi 40 dosis 20ml plan vacunal Reproductores : Cada 4-6 meses . Repo.ici6n : A las 10-12 semanas de vida . Engorde : Al destete o al mes de vida. 1 mi 4 mi !1">;¡ry;:(3J ! '~i I ~'empJO práctico en una superficie I~  i~l"" ~W  II 1 p~~~: :e1distrtbuClon para una Insta /aCloo ~ . _ __ de 500 conejas reproductoras con sus machos I " li ~ l· ...,. 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EL SISTEMA!! Tabla 2 Recuento de E coli de 35 conejos procedentes de 22 granjas Variedad de o a 100.000 UFC/ g más de 100.000 UFC E. coli aislado aglutinante con serogrupo 0103 2 6 E. .coli aislado aglutinante con serogrupo 0132 O 1 E. coli no aglutinantes con 0132 o 0103 Aislamiento, numeración e identificación. A partir de cada uno de los conejos utilizados se realizó una extracción de contenido cecal, el cual fue dilurdo en 10 mI. , de solución Ringer. Tras agitarse y filtrarse sobre una gasa estéril, se realizaron diluciones sucesivas a 10- 3 , 10- 5 , 10- 7 , 10-9 Y 10- 1°, sembránd ose 1 mI. de cada dilución en gelatina con lactosa-desoxico-Iato y contabilizándose las colonias por gramo del contenido del ciego. Paralelamente a la numeración, se realizó un aislamiento de contenido cecal en medio de Drigalsky. Las colonias productoras de lactosa se caracterizaron med iante el test API 20 E. La prueba de aglutinación sobre porta permitió señalar los serogrupos O 103 Y O 132. Las distintas cepas fueron conservadas en un medio adecuado para la conservación de las cepas del Instituto Pasteur y a la temperatura de 4°C. Estudio de la sensibilidad ante los an-tibióticos. Para el control se utilizó el método de difusión en gelatina; la determinación de las mrnimas concentraciones inhibitorias se efectuó en un medio sólido para la Amoxici-lina y Ticarcilina, según el método de Steers. El medio utilizado fue la gelatina de Muller-Hinton del Instttuto Pasteur, en la que las concentraciones crecientes de antibióticos se incorporaron a 10 microlitros d e un cultivo que contenra 106 bacterias por mi sobre la superficie de la placa. Las C.M.1. se leyeron después de 24 horas a 37° de temperatura. Investigación de la presencia de una beta-lactamasa. Para las cepas resistentes a las betalactaminas, la producción de betalacta-masas se puede poner en evidencia utilizando un método de difusión en gelatina: un disco con 25 mcg de amoxicilina y un disco de la asociación amoxicilina (20 mcg) más ácido clavulánico (10 mcg) fueron utilizados para cada cepa. Si la cepa resultaba resistente a la amoxicilina y sensible a la asociación febrero 1988 I cunicultura 24 2 amoxicilina + ácido clavulánico indicaba que la cepa era productora de una penicilinasa de origen generalmente plasmático. Estudio del soporte de la beta/actamasa y factor de virulencia (colonización del ciego). Transporte por conjugación: La primera operación es la obtención de mutantes cromosómicos con respecto a cada antibiótico para cepas de E. coli receptoras o donantes. Se decidió utilizar mutantes resistentes a la rifampicina para las cepas receptoras y ob-tener mutantes resistentes al ácido nalidrxico para las donantes. Estas caracterrsticas de resistencia permiten realizar fácilmente anti-biogramas de diversas cepas transferidas e interpretar fácilmente los resultados. La obtención de mutantes se ha realizado por siembra en placas de gelatina que conten-gan 300 mg/ litro de r~ampicina o 150 mg/ litro de ácido nalidrxico. Además de estos estudios se efectuaron ex-tracciones de ADN plasmrdico e infecciones experimentales con variedades portadoras de plásmidos con antibiorresistencia. Resultados Los análisis realizados sistemáticamente durante 6 meses en el Laboratorio de los Servicios Veterinarios del Puy-de-Dome, señalaron que el 26% de los animales pre-sentaban en el ciego un mrnimo de 10° E. coli por g -12 cepas-, conforme viene señalado en las tablas 1 y 2. Es de destacar que se detectaron los siguientes hechos: -9 de cada 11 variedades de Escheri-chia coli O 103 resultaron estar en situación patógena. -Sólo 1 Escherichia coli O 132 se halló como patógeno y procedra de un conejar tradicional. -Los Escherichia coli 0103 fueron aislados 15 más a partir de granjas racionales que de conejares trad icionales. Especificidad de los serogrupos O 103 Y O 132 para el conejo. Todos los colibacilos de origen an imal aislados durante algunas semanas en 1987, fueron estudiados con los antisueros 0103 y 0132. Los resultados obte-nidos, agrupados en la tabla 3 muestran que pues que los serotipos O 103 son específicos de los lagomorfos. El serogrupo 0132 se iden-tificó en un criadero industrial de pintadas. Sensibilidad de las cepas a los antibióticos. El balance de la sensibilidad ante seis an-tibióticos, de las 12 estirpes de E. coli aisla-das en 1987, presentan una numeración alta como puede apreciarse en la tabla 4. Tabla 3. Ensayo de aglutinación de los E. cofí 0103 y 0132 a partir de aislamientos en animales diversos Origen de las cepas N.o de E. coll 0103 positillo 0132 pa;iUIIO cordero 6 O O ternero 2 O O oveja 1 O O pollo 10 O O pintada 5 O 1 pollito 2 O O perro 1 O O cobayo 1 O O liebre 3 1 O hombre 16 O O el serogrupo O 103 también fue señalado en una liebre procedente de un cunicultor que también producía animales de este tipo. En el cuadro de nuestra experimentación parece Si se compara la frecuencia de resistencias a las de 41 cepas procedentes de animales diarréicos, observamos cómo hay una regula-ridad en los resultados -tabla 5-. Observamos 16 Tabla 4. Frecuencia de resistencia a algunos antibióticos de 12 cepas de E coli aislados en 1987 Antibl6lico ensayado N.o de cepas resistentes % de resistencia Carbenicilina 4 33% Neomicina 6 50% Tetraciclinas 12 1()()% Trimetoprim-sulfa 2 16% Colistina O 0% Acido nalidíxico O 0% Tabla 5. Frecuencia de resistencia de 41 cepas de Escheríchia coN 0103 frente a diversos antibióticos Antibiaico N. o de cepas r~¡slenles % de resistencia Garbenicilina 9 22% Neomicina 11 27% Tetraciclinas 29 71% Trimetoprim + Sulfa 16 39% Colistina O 0% Acido nalidíxico O 0% febrero 1988 I cunicultura en particular cómo ciertas cepas son resis-tentes a la carbenicilina. Estas resistencias se deben a aparición reciente y no puede explicarse por el papel selectivo de la be-talactamina, pues dicho antibiótico no había sido utilizado nunca en laterapéutica de los conejos. Estudio de la resistencia a las beta/actami-nas. Las concentraciones mínimas inhibido-ras de la amoxicilina y de la ticarcilina ante las 12 cepas de Escherichia coli precedentes y de las 41 cepas de O 103 demuestran que el 74% de las mismas fueron sensibles a la Amoxicilina (CMI < 1 mcg¡ ml) ya la Ticarcilina (CMI <4 mcg¡ml). Las 13 cepas resistentes a estas betalac-taminas presentaron las CMI de 32 a 512 y de 128 a 1.024 respectivamente para la amo-xicilina y la ticarcilina debidas sin duda a la presencia de una betalactamasa tipo penici-linasa, pues dichas cepas son sensibles en presencia de betaJactamasa. Búsqueda y localización de los genes que intervienen en la síntesis de las beta/actama-sas y que permiten una colonización en el contenido ceca/. En un primer momento se ha logrado transferir la resistencia a las be-talactaminas; la cepa de E. coli número 989 multiresistente, aislada en una concentración de 1010 gérmenes por gramo de contenido cecal se utilizó como estirpe donante, y la . cepa número 568 aislada de un contenido cecal de sólo 10' colibacilos y sensible a todos los antibióticos actuó como receptora. Los transjugantes obtenidos producen be-talactamasa, son resistentes a la amoxic il ina y ticarcilina, pasando a ser además resistentes a la Neomicina y al cloranfenicol. febrero 1988 I cun icultura Conclusión El análisis de los resultados señala con respecto a ciertas cepas de E. coli aisladas en los conejos que éstas son poseedoras de resistencias múltiples a los antibióticos y de forma muy particular ante las betalactaminas. Sería interesante estudiar el enzima resultante de esta res istencia en todas las variedades para saber si el origen de este fenómeno es idéntico sea cual sea el tipo de granja y su origen geográfico y si esta enzima posee un perfil de actividad tipo penicilinasa. Hay una tendencia a enviar los animales para identificar la presencia de la cepa O 103; nuestra experiencia tiende a mostrar que la virulencia de determinadas cepas no se debe únicamente a la naturaleza o características de la pared bacteriana -antígeno 0- sino a factores genéticamente codificados por un plásmido autotransplantado. La cepa 568, no patógena, después de ser transplantada con un plásmido de la cepa patógena número 989 se hizo capaz de colonizar el ciego como lo hacía esta última. Estudios ulteriores deberían precisar si es-tos genes codifican la síntesis de proteínas en superficie, permitiendo la adhesividad de las bacterias o la producción de toxinas. Estas consideraciones harían pues ne-cesario un recuento de los E. coli del ciego de forma sistemática, estableciendo el diagnóstico serológico en función de los re-cuentos superiores a 100.000 colibaci los por gramo de contenido cecal. Este protocolo per-mitiría supervisar de cerca la persistencia o la aparición de nuevas resistencias antibióticas en las cepas patógenas del conejo. 17 

Especificidad, antibiosensibilidad y virulencia de las cepas de Escherichia coli aislados del ciego del conejo

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