Caractérisation dʼune nouvelle famille de protéines impliquées dans lʼassemblage du fuseau mitotique des plantes supérieures

Abstract

Dans les cellules eucaryotes, la division cellulaire nécessite l’assemblage d’une structure bipolaire complexe appelée fuseau mitotique. L’assemblage de ce fuseau est initié par la nucléation de microtubules. Dans les cellules méiotiques de vertébrés, les microtubules sont nucléés autour de la chromatine et forment un fuseau en l'absence de centrosome. Cette voie de signalisation dépendante de la chromatine fait intervenir un gradient de Ran GTPase activée (Ran-GTP). Un des effecteurs protéiques impliqués dans cette voie est TPX2 (pour Targeting Protein for Xklp2). En interphase, TPX2 est localisée dans le noyau sous une forme inactive, associée aux importines. En début de mitose, TPX2 est libérée des importines par Ran-GTP et induit la nucléation de microtubules autour de la chromatine. Outre son importance dans la nucléation des microtubules, elle est nécessaire à la localisation de la kinase Aurora A aux pôles fusoriaux et à son activation par autophoshorylation. Une fois activée, la kinase va phosphoryler TPX2 et de nombreux autres facteurs impliqués dans différents aspects de la division cellulaire. Les plantes supérieures assemblent leur fuseau en l'absence de centrosome. Un pré-fuseau prophasique est formé avant rupture de l'enveloppe nucléaire par convergence de microtubules nucléés au niveau de la membrane externe. Des études récentes suggèrent que les mécanismes impliqués dans la formation de ce fuseau pourraient faire intervenir des voies de signalisation proches de celles rencontrées dans les cellules méiotiques animales. En effet, de nombreux gènes impliqués dans la formation du fuseau animal ont des homologues chez les plantes, codant notamment pour des kinases de type AURORA ainsi que pour Ran et ses principaux partenaires. Au cours de mon travail de thèse, j’ai cherché à identifier et caractériser l’homologue végétal de TPX2 et à évaluer son implication dans l’assemblage du fuseau mitotique des plantes. Des recherches par comparaison de séquences ont permis d’identifier une protéine d’Arabidopsis encodée par un gène unique (AT1G03780), baptisée AtTPX2. Les données présentées dans cette thèse décrivent les caractéristiques structurales et fonctionnelles d’AtTPX2 et démontrent que cette protéine est l’orthologue des TPX2 animales. La dynamique particulière d’AtTPX2 qui précède la rupture de l’enveloppe nucléaire suggère que les plantes ont développé un système d’export de la protéine afin d’assembler correctement leur fuseau mitotique en l'absence de centrosome. D’autre part, cette étude a permis d’identifier d’autres protéines végétales possédant certains domaines.Higher plant cells are characterized by dispersed microtubule organizing centers. During interphase, they were identified at the nuclear surface, close to the cortex and along pre-existing microtubules. However, the mechanisms of spindle microtubule assembly remain largely unknown. In acentrosomal animal cells like Xenopus oocytes, the Targeting Protein for Xklp2 (TPX2) was characterized as an essential player in perichromosomal spindle assembly, suggesting that it may be a central regulator of spindle formation without centrosomes. The aim of this work was first to identify and then to functionally characterize the Arabidopsis orthologue of TPX2. The best candidate corresponded to a single gene refered as AT1G03780. Stable transformants of Arabidopsis plants and tobacco BY-2 cells expressing GFP-AtTPX2 fusions were obtained. The fusion protein was targeted within the nucleus in interphase and actively exported shortly before nuclear envelope breakdown (NEB), probably participating in prospindle formation around the prophase nucleus. This behaviour differs from animal cells in which TPX2 nucleates microtubules only after NEB. In prometaphase, AtTPX2 colocalizes with spindle fibers and is rapidly degraded in telophase, like in vertebrates, suggesting that the protein is involved in early steps of mitosis. We characterized two nuclear localization signals, one nuclear export signal and two microtubule binding domains specific for the Arabidopsis protein, arguing in favor of its intracellular targeting and dynamics we followed. Furthermore, AtTPX2 was shown to rescue microtubule nucleation in a TPX2-depleted Xenopus extract, indicating that this function is conserved in the plant protein. In addition, the injection of anti-TPX2 antibodies in Tradescantia stamen hair cells inhibited cell division just before NEB. We identified by BLAST analysis several other proteins sharing similarities with AtTPX2 domains. Subcellular analysis has shown that these AtTPX2 like proteins have the property to bind microtubules and to shuttle between nucleoplasm and cytoplasm. All together, our data provide new insights into plant cell division, suggesting that throughout evolution, TPX2 has conserved essential functions in spindle assembly. Furthermore, this work revealed that a large number of AtTPX2 paralog does exist, suggesting a wide plant specific evolutionary radiation