The mechanism of action of polerovirus P0 in RNA Silencing suppression

Abstract

Les polerovirus appartiennent à une famille de phytovirus (Luteoviridae) capables d’infecter de nombreuses plantes d’intérêt agronomique. Leur génome est composé d'un RNA simple brin de polarité positive dont l'ORF, situé à l’extrémité 5’, code pour la protéine P0 de 29 kDa, un suppresseur fort de Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS). Ce phénomène d’extinction de gènes est un moyen de défense antiviral chez les plantes. Afin d’étudier le mécanisme d'action de la protéine P0, nous avons criblé une banque cDNA d’Arabidopsis thaliana en système double hybride de levure. Deux protéines de la famille des protéines SKP1-like d'Arabidopsis (ASK) ont été identifiées comme partenaires cellulaires de la protéine P0. Les protéines ASK font partie des complexes SCF, un type d’E3 ubiquitine ligases impliquées dans la voie d'ubiquitination et de dégradation par le protéasome 26S. Ces complexes renferment également une protéine à F-box qui se lie à la protéine ASK par son domaine F-box et dont le rôle est la reconnaissance spécifique des protéines à dégrader. Un motif F-box a été identifié dans la partie N-terminale de la protéine P0. Une mutation ponctuelle dans ce motif entraîne la perte d’interaction avec les protéines ASK ainsi que la perte d'activité de suppression de silencing de la protéine P0. Introduite dans le génome viral, cette mutation confère une baisse importante de la pathogénicité du virus. Par ailleurs, des plantes de Nicotiana benthamiana, dans lesquelles l’expression du gène SKP1 a été diminuée par la technique du Gene Silencing induite par un virus (VIGS), se sont avérées résistantes à l'infection par les polerovirus. Une deuxième approche du mode d’action de la protéine P0 résulte de la transformation d’A. thaliana par le gène codant pour P0 sous le contrôle d'un promoteur inductible. En condition d’induction, ces plantes présentent un phénotype anormal rappelant certains mutants touchés dans le développement. L’analyse de l’expression des mRNAs endogènes, cibles de miRNAs a montré que certains sont surabondants dans les plantes induites, suggérant que P0 pourrait interférer avec la voie des miRNA. Par ailleurs nous avons montré que la protéine P0 est capable de supprimer le PTGS de type «Inverted-Repeat», indiquant qu’elle agirait à une étape située en aval de l'activité de Dicer (DCL). Parmi les protéines candidates cibles de P0 figure ARGONAUTE1 (AGO1), une protéine essentielle du complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Nous avons pu montrer que l’expression de P0 conduit à la dégradation spécifique de la protéine AGO1 aussi bien en condition d'expression transitoire que dans les plantes d’Arabidopsis transformées «P0-FlagAGO1». De plus, une interaction physique entre P0 et AGO1 a été démontrée in vitro et in planta, favorisant l'hypothèse qu'AGO1 est bien la cible directe de P0. Nos données soutiennent un modèle dans lequel P0 agirait comme une protéine à F-box, recrutant la voie de modification post-traductionnelle pour inhiber le système de Gene Silencing post-transcriptionnel. Dans ce modèle, la P0 interagirait avec la protéine SKP pour constituer un complexe SCFP0 conduisant la protéine AGO1 vers l'ubiquitination et la dégradation par le proteasome 26S. C'est le premier exemple de suppresseur de silencing capable d’intégrer un complexe SCF pour induire la dégradation d'un composant essentiel de la voie du gene silencing, et de ce fait, inhiber la défense antivirale de la plante hôte.The poleroviruses are an agronomically important genus of plant viruses which can infect a wide range of hosts. Their genome is a single-stranded plus-sense RNA. The 5’-terminal ORF encodes the 29 kDa protein P0, a strong suppressor of Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS), an important antiviral defense system in plants. I have investigated the mechanism of action of P0 in suppression of RNA silencing. A yeast two-hybrid screen of an Arabidopsis thaliana cDNA library identified two closely related Arabidopsis SKP1-like proteins (ASK) as a cellular partner for P0. ASK is a component of the SCF class of E3 ubiquitin ligases involved in the protein ubiquitination and degradation pathway. A conserved F-box like-motif was identified near the N-terminus of P0, suggesting that P0 is a viral-coded F-box protein. F-box proteins are the components of the SCF complex that specifically recognize target proteins. The targets are then usually polyubiquitinated as a marker for proteolysis by the 26S proteasome. P0 mutated in the F-box motif did not interact with ASK and conferred low pathogenicity to the virus in plants. Nicotiana benthamiana in which SKP1 levels were knocked down by virus-induced gene silencing were resistant to polerovirus infection. The F-box motif was also essential for silencing suppression activity of P0 in an agroinfiltration assay. Transgenic Arabidopsis expressing P0 under control of an inducible promoter showed abnormal phenotypes. A subset of miRNAs in the induced P0 plants accumulated less abundantly than in non-induced plants and miRNA-targeted endogenous transcripts were upregulated, indicating that P0 interferes with the miRNA pathway. P0 also suppressed IR-PTGS at a step downstream of Dicer (DCL) activity, suggesting that ARGONAUTE1 (AGO1), the slicer protein in the RNA-induced silencing complex (RISC) might be the target of P0. Indeed, P0 specifically provoked AGO1 degradation in both transient expression experiments and in crossed P0-FlagAGO1 Arabidopsis. A physical interaction between P0 and AGO1 was demonstrated both in vitro and in planta, favoring the hypothesis that AGO1 is the direct target of P0. Our data support a model in which P0 acts as an F-box protein, recruiting the post-translational modification system to overcome the post-transcriptional gene silencing system. In this model P0 interacts with SKP to constitute a SCFP0 complex which presumably addresses AGO1 for ubiquitination and degradation by 26S proteasome. This would be the first example of a suppressor of RNA silencing that acts in an SCF complex to promote degradation of an essential component of the silencing pathway, thereby, inhibiting the plant antiviral defense