Boué, A.

Boué, J.

Jaume Roig, B.

Simon-Bouy, B.

Taillandier, A.

Simon Bouy, B.

Taillander, A.

DIALNET

Aplicación de la biología molecular a la detección de portadores de fibrosis quística de páncreas

Biblioteca Digital de les Illes Balears

Original introducción 
Aplicación de la 
biología molecular 
a la detección de 
portadores de 
fibrosis quística de 
páncreas 
B. Jaume R o i g , * , * * B. S imon-Bouy , * * 
A. Tai l landier,** J . Boué , * * A. B o u é * * 
Resumen 
Desde hace unos años, la tecnología del 
A D N recombinante ofrece un nuevo ca-
mino para investigar las enfermedades ge-
néticas. De una forma discreta pues, las 
técnicas de la biología molecular van en-
t rando paulat inamente en la medicina 
práctica, y si su campo de aplicación (pre-
vención, diagnóstico...) es aún l imitado, el 
clínico debe ya interesarse y conocer los 
diferentes aspectos beneficiosos que esa 
nueva tecnología puede aportar a la ge-
nética humana. 
En este trabajo de invest igación, se pre-
senta una de sus múlt iples aplicaciones, 
como es la detección de portadores hete-
rocigotos en famil ias con indiv iduos afec-
tos de fibrosis quística de páncreas o mu-
coviscidosis. 
* Laboratorio de Genética. Pabellón Materno-
Infantil. Hospital Son Dureta. Cl Andrea Doria, 
55. 07014 Palma de Mallorca. 
** Unité 73. Institut National de la Santé et de la 
Recherche Medícale. Cháteau de Longchamp. 
Bois de Boulogne. 75016 París (Francia). 
La f ibrosis quística de páncreas (FQ), es 
una enfermedad monogénica de herencia 
autosómica recesiva. Es decir, los padres 
de un indiv iduo afecto FQ son portadores 
obligados del cromosoma alterado. Su fre-
cuencia en la población caucásica es de 
1/2.500 recién nacjdos v ivos, siendo 1 
adul to de cada 25, portador del gen anó-
malo. 
El gen, cuya(s) mutación(es) produce(n) la 
enfermedad se ha localizado en el brazo 
largo del c romosoma 7 ( 7 q . 3 1 ) . 1 3 Su de-
fec to bioquímico se desconoce actual-
mente , creyéndose relacionado con la re-
gulación del t ransporte de aniones en la 
membrana epi te l ia l . 4 , 5 
Las manifestaciones clínicas de la FQ se 
caracterizan por ser al tamente variables, 
s iendo básicamente de 2 t ipos: respirato-
rias (broncopatía crónica obstructiva) y/o 
d igest ivas. 8 
Enfermedad heterogénea, las manifesta-
ciones respiratorias no se encuentran pre-
sentes siempre desde el inicio de la enfer-
medad (que puede ser simplemente diges-
tiva), pero aparecen con el t iempo en la 
mayoría de los casos (85%) y condiciona-
rán el mal pronóst ico en más de un 9 5 % 
de los afectos. Una sintomatología respi-
ratoria evocadora de FQ será tos crónica, 
disnea y bronquit is infecciosas y/o asma-
t í formes, marcadas sobre todo por su ca-
rácter recidivante. Las alteraciones diges-
tivas están caracterizadas básicamente por 
un síndrome de malabsorcíón con diarrea 
crónica, responsable del retraso estaturo-
ponderal, que contrasta con el apeti to vo-
raz largo t iempo conservado. Las deposi-
ciones son abundantes, pastosas, bril lan-
tes y malol ientes. Otros síntomas digest i-
vos serán: íleo meconial en período 
neonatal , con cuadro clínico de oclusión 
intestinal ( 1 0 - 1 5 % ) , 6 ' 7 retraso en la elimi-
nación del meconio y prolapso rectal. Si 
bien, en la mayoría de los casos, el cua-
dro clínico aparece en los primeros meses 
de vida o dentro del primer año, hay des-
critas formas tardías de la enfermedad. 
Finalmente, varios exámenes paraclínicos 
142 
serán de gran uti l idad para un claro diag-
nóst ico: 
— Test del sudor. Es básica una perfecta 
técnica y puesta a punto para descartar los 
falsos posit ivos, requiriéndose un mínimo 
de 2-3 tests para conf i rmar el diagnóst i-
co. En la FQ, se considera valor patológi-
co un valor de cloro superior a 60 mEq/l . 
— Esteatorrea. Confirma la maldigest ión 
lipásica (valor normal: < 3 gr./24 hrs.; FQ: 
>4-5 grs./24 hrs.). 
— Determinación neonatal de la tr ipsina 
inmunorreact iva. 
— Una radiografía torácica permitirá apre-
ciar el estado pulmonar. 
Sin embargo, ninguna de dichas manifes-
taciones y/o pruebas permiten conocer 
qué indiv iduos, dentro de una familia con 
un individuo afecto FQ, son portadores del 
c romosoma alterado. Hay que tener en 
cuenta que los hermanos de un afecto FQ, 
t ienen un riesgo mayor de ser portadores 
que la población normal . 
Es a partir de la localización en el año 
1985, del gen de la FQ, en 7 q . 3 1 , y gra-
cias a técnicas de genética molecular 
cuando se realizan más avances en la in-
vest igación de la FQ. No ha sido posible 
hasta ahora conocer el defecto genét ico 
responsable de la FQ y no puede realizar-
se por lo tanto un análisis directo del gen. 
Sin embargo, puede analizarse de forma 
indirecta mediante el estudio de sondas 
moleculares que están muy cerca de di-
cho locus génico. El estudio con estas son-
das moleculares cercanas al gen en fami-
lias con un indiv iduo afecto FQ permite, 
s iguiendo la segregación de dichas son-
das (marcadores) conocer de que forma 
se ha transmit ido (segregado) la mutación 
y, con ello, conocer qué indiv iduos den-
tro de la famil ia son portadores. 
En el esquema 1 , se observa el idiograma 
del c romosoma 7 con algunas de las son-
das moleculares que f lanquean de uno y 
otro lado el locus CF (FQ), así como las 
sondas empleadas en este estudio y las 
endonucleasas o enzimas de restricción 
que posibil itan, mediante el reconocimien-
to de un determinado pol imor f ismo bialé-
lico, la conveniente interpretación molecu-
lar. 
y 
CROMOSOMA 7 
TABLA I 
SONDAS ENDONUCLEASAS ALELOS 
7c22 Eco RI 1: 7,2 Kb 
2: 5,1 Kb 
met D Taq I 1: 5,0 Kb 
2: 4,0 Kb 
met H Taq I 1: 7,0 Kb 
2: 4,2 Kb 
PT-3 Ban II 1: 0,6 Kb 
2: 0,5 kb 
XV-2c Taq I 1: 2,1 Kb 
2: 1,4 Kb 
KM.19 Pst I 1: 7,8 Kb 
2: 6,6 Kb 
J3.11 Msp I 1: 4,2 Kb 
2: 1,8 Kb 
Para un estudio familiar dos requisitos son 
fundamentales: 
— Tener un claro diagnóst ico clínico de 
la enfermedad. 
— Disponer de muestras del indiv iduo 
afecto, sus progenitores y, secundaria-
mente, de sus hermanos/as (si los hay). 
Se inicia el estudio a partir de las sondas 
moleculares más cercanas a uno y otro 
lado del locus génico. Con ello, se busca 
informatividad, es decir, la posibi l idad 
que, mediante el estudio y análisis de la 
143 
forma de segregación de una sonda o va­
rias de ellas (haplotipo), podamos discer­
nir entre el c romosoma normal y el altera­
do FQ. Si la informat iv idad hallada no es 
suf iciente, se cont inúa con otras sondas 
más alejadas del locus. 
Método 
El A D N , que puede ser extraído de cual­
quier célula nucleada (en nuestro caso, 
leucocitos de sangre periférica), es digerí-
do con las enzimas de restricción Taq I, 
Pst I, Msp I y Ban II, según técnicas ya 
descritas.^ Tras la separación electroforé-
t ica en geles de agarosa al 0 ,8%, los f rag­
mentos de A D N son transferidos a un so­
porte sól ido (nylon o nitrocelulosa), y se 
híbridan con las sondas met D, met H, XV-
2c, KM.19, J3.11 y pT-3 marcadas radioac­
t ivamente. Tras la conveniente autorradio-
grafía podrán estudiarse los Fragmentos 
de Restricción de Longi tud Polimórfica 
(FRLP) que nos permit i rán realizar el diag­
nóst ico molecular (Tabla II). 
DNA 
filtro de nitrocelulosa 
gel 
solución salina 
fragmentos 
gel de agarosa 
electroforesis 
ADN total 
desnaturalización al 
estado de simple cadena 
— i - ' y í filtro recibe la réplica del gel 
filtro 
solución de 
hibridación 
con sonda 
radioactiva 
lavado y 
autorradiografía 
la autorradiografía muestra únicamente 
el fragmento complementario o la sonda 
TÉCNICA DEL «SOUTHERN BLOTTING» 
— Extracción del ADN 
— Digestión por un enzima de restricción 
— Electroforesis en gel de agarosa 
— Transferencia sobre filtro 
— Hibridación con una sonda (ADN genómico o ADNc) 
— Autorradiografía 
144 
Resultados 
Como ejemplo de aplicación de las técni-
cas descritas, se presentan en este traba-
jo, el análisis molecular de 2 famil ias que 
tenían, al menos, un caso-índice FQ. Di-
cho estudio forma parte de un más am-
plio trabajo de investigación realizado en 
familias españolas afectas de tal patología, 
procedentes mayoritariamente de la Cuen-
ca Mediterránea Española (Cataluña, Va-
lencia, Murcia...) así como las poblaciones 
insulares (Baleares y Canarias). 
En la famil ia 1 (familia L-C), la determi-
nación de los haplotipos con 5 sondas mo-
leculares ha permit ido identif icar, dentro 
de una misma fratría, los dos cromosomas 7 
portadores de la mutac ión, y en conse-
cuencia, seguir la segregación del gen. 
Así, los individuos 11-1 y II-7 son homoci -
gotos afectos FQ, mientras que los indivi-
duos II-2, II-3 y II-5, así como los individuos 
II-4 y II-6 son heterocigotos paternos y ho-
mocigotos sanos respect ivamente. 
Sin embargo, no sólo es importante la de-
tección de portadores del cromosoma mu-
tado en la misma fratría del caso afecto 
FQ, sino también en las generaciones an-
teriores (hermanos paternos y maternos). 
En la famil ia 2, vemos que es el alelo E2 
de la sonda KM.19 el asociado a la enfer-
medad, ya que el indiv iduo V-1 (afecto 
FQ), lo presenta en estado de homocigo-
sis (E2E2), siendo sus padres (III-2 y III-7), 
heterocigotos (E1E2). 
La pareja III-3/III-8 acudió a consulta ge-
nética para saber si eran portadores y, tras 
el conveniente estudio y análisis molecu-
lar, se comprobó que si bien III-8 era por-
tadora del alelo E2, que en esta concreta 
famil ia es el que segrega con el gen mu-
tado , el indiv iduo III-3 no era portador del 
c romosoma alterado. 
Conclusiones 
Hemos podido constatar, con este traba-
jo , el gran desarrollo que en los úl t imos 
años se ha producido en las ciencias bio-
médicas gracias a la biología molecular. 
Así, la tecnología del A D N recombinante 
ha supuesto un gran cambio en el diag-
nóstico e investigación clínico-biológica de 
enfermedades hematológicas (talasemias, 
hemofilias...), neuromusculares (distrofias 
FAMILIA 1 
FAMILIA L-C 
CF N E, B. N CF 
A1 A2 
B2 B1 
D1 D1 
E2 E2 
C2 C2 
A1 A1 
B2 B2 
DI D1 
E2 E2 
C2 C2 
A1 A1 
B2 B2 
D1 D2 
E2 E1 
C2 C2 
A1 A1 
B2 B2 
D1 D2 
E2 E1 
C2 C2 
A2 A1 
B1 B2 
D1 D2 
E2 E1 
C2 C2 
A I A1 
B2 B2 
D1 D2 
E2 E1 
C2 C2 
A2 A1 
B1 B2 
D1 D2 
E2 E1 
C2 C2 
A l A l 
B2 B2 
D1 D1 
E2 E2 
C2 C1 
A1 A l 
B2 B2 
D2 D1 
E1 E2 
C2 C1 
CF CF CF N CF N N N CF N N N CF CF 
MARCADORES ANALIZADOS: Met D (A); Met H (B); XV-2c (D); KM.19 (E); J3.11 (C) 
145 

de Duchenne-Bécker...), onco lóg icas . . . 1 0 
Sin embargo, en muchas de ellas (Corea 
de Hunt ington, neurof ibromatosis, polí-
quistosis renal, atrofia espino-muscular...), 
se cont inúa invest igando mediante esta 
tecnología y otras nuevas que van apare-
ciendo (Polymerase Chain Reaction...) para 
mejorar el d iagnóst ico, prognosis y posi-
ble terapia, t odo ello tendente a mejorar 
la cal idad de vida del paciente. 
La genética molecular ha dado, a lo largo 
de estos años, prueba del gran potencial 
que representa, de ahí el necesario apo-
yo, dentro de un marco objet ivo de inves-
tigación-diagnóstico que a dicha biotecno-
logía debería dársele para su aprovecha-
miento y desarrollo. 
Agradecimientos 
Quiero expresar mi personal agradecimiento a la Obra 
Social de la Caja de Ahorros de Baleares, Sa Nostra, 
por su ayuda para la realización de este trabajo en 
la Unité 73 del Institut National de la Santé et de la 
Recherche Medícale en París bajo la dirección del Prf. 
André Boué. Agradezco asimismo a los Dres. Gar-
cía, Román, Ballesta, Vázquez, Vargas, Antich, Be-
llón, Seculi, Amat, Solé, Peña y Calabuig su confianza, 
interés y dedicación al remitirnos familias afectas de 
FQ desde varios puntos de nuestro país para su aná-
lisis molecular. 
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147 


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