Synthese, Charakterisierung und Evaluierung von Antikörperkonjugaten mit Dendrimer-basierten Chelator- und Fluoreszenzfarbstoffmultimeren für die Krebsdiagnostik und Therapie
Für eine Verbesserung der radiometallbasierten Diagnostik und Therapie sowie der Diagnostik mittels Fluoreszenzfarbstoffen wurden Chelatbildner- und Fluoreszenz-farbstoff-Multimere auf der Basis von PAMAM-Dendrimeren hergestellt. Diese wurden in den EGF-Rezeptor bindenden Antikörper Matuzumab eingeführt und die synthetisierten Antikörper-Multimer-Konjugate hinsichtlich ihrer Immunreaktivität untersucht. Für die Herstellung der Multimere musste zunächst die Synthese der PAMAM-Dendrimere optimiert werden, da mittels publizierter Methoden nur Dendrimere unzureichender Homogenität erhalten werden konnten. Hierdurch war es möglich, Dendrimere mit einer bis 128 Aminfunktionen in hoher Homogenität herzustellen. Die Dendrimere wurden auf einem Pentaethylenglycol-Linker aufgebaut, der eine Thiol-Funktion für die Umsetzung mit Antikörpern trug. Es wurde eine große Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen auf ihre Multimerisierbarkeit auf diesen Dendrimer-Cores untersucht. Allerdings wiesen nur Dansylchlorid, NBD-chlorid, Coumarin 343, 5(6)-Carboxyfluorescein-pentafluorphenylester und Sulforhodamin B2 Fluorid ausreichend hohe Reaktivitäten mit den Aminfunktionen der PAMAM-Dendrimere auf. Die Untersuchung der Fluoreszenzeigenschaften der hergestellten Farbstoff-Multimere zeigte allerdings, dass sich für eine Multimerisierung zur Verstärkung von Fluoreszenzsignalen einzig Dansylchlorid eignet. Folglich wurden Dansyl-Multimere mit 1 bis 128 Dansylresten synthetisiert und mittels Größenausschlusschromatographie, HPLC, NMR und Massenspektroskopie charakterisiert. Die Dansyl-Multimere Dansyl8-SH, Dansyl16-SH, Dansyl32-SH und Dansyl64-SH wurden in den anti-EGFR Antikörper Matuzumab eingeführt, wobei sich zeigte, dass sich die größeren Dansyl-Multimere Dansyl32-SH und Dansyl64-SH nicht für eine Derivatisierung von Antikörpern eignen, da sie, wahrscheinlich aufgrund ihrer hohen Lipophilie, bei Einführung in das Protein zur Denaturierung des Antikörpers führten. Das Dansyl16-Antikörper-Konjugat war somit das größte herstellbare Konjugat, das isoliert und charakterisiert werden konnte. Diese Verbindung wurde an HT29-Zellen hinsichtlich ihrer Immunreaktivität untersucht und zeigte relativ zum underivatisierten Antikörper eine zu 54% erhaltene Immunreaktivität. Für die Herstellung der Chelat-Multimere wurden zunächst die bekannten Syntheseprotokolle der als Synthon benötigten DOTA-Derivate Tris-tBu-DOTA, Thiol-DOTA und Tris-benzyl-DOTA verbessert. Neben diesen Derivaten wurden weiterhin Tris-allyl-DOTA, DOTA-PFP-ester und DOTA–PNP-ester sowie ein neues Derivat, Tris-4-nitrobenzyl-DOTA, hergestellt und mit den Dendrimeren umgesetzt. Einzig Thiol-DOTA ließ sich quantitativ in die Dendrimere einführen und ergab die gewünschten Chelat-Multimere mit 1 bis 128 DOTAs in hoher Homogenität, die nach ihrer vollständigen Charakterisierung in den Antikörper Matuzumab eingeführt wurden. Dabei wurde sowohl die Anzahl als auch die Größe der eingeführten Multimere variiert, um systematisch zu untersuchen, welchen Einfluss die Größe und die Anzahl der gekoppelten Dendrimere auf die Immunreaktivität der derivatisierten Antikörper haben. Es sollte herausgefunden werden, ob ein Optimum mit größtmöglicher Anzahl von Chelatbildnern und geringst möglicher Verschlechterung der Immunreaktivität erreicht werden kann. Die erhaltenen Antikörper-Multimer-Konjugate wurden hinsichtlich ihrer Immunreaktivität an HT29-Zellen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Größe des angekoppelten DOTA-Multimers über einen weiten Molekulargewichtsbereich nur einen geringen Einfluss auf die Immunreaktivität des Antikörper-Konjugates hat, dass jedoch die Anzahl der Derivatisierungsstellen pro Antikörper einen drastischen Einfluss auf die Immunreaktivität der Konjugate hat
