On the trail of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and Mycobacterium bovis in mainland Portugal: a microbiological and molecular survey in wildlife

Abstract

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A paratuberculose e a tuberculose bovina são duas doenças infeciosas causadas por micobactérias patogénicas, com uma elevada importância ao nível da saúde e bem-estar animal e que provocam perdas económicas substanciais associadas à diminuição de produtividade, limitações ao comércio de animais e de produtos de origem animal e o abate sanitário de animais infetados, no caso da tuberculose. Acresce que, devido ao potencial zoonótico dos respetivos agentes etiológicos e apesar de estar ainda por demonstrar inequivocamente a associação do agente da paratuberculose à doença de Crohn em humanos, é necessário reforçar o conhecimento sobre a epidemiologia destas doenças, nomeadamente através de uma melhor caraterização dos agentes patogénicos, os seus hospedeiros, as vias de transmissão e a patogenia. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) é o microorganismo responsável pela paratuberculose ou doença de Johne, uma infeção crónica do trato gastrointestinal que afeta ruminantes em todo o mundo. Os ruminantes parecem ser o hospedeiro preferencial de MAP, contudo esta micobactéria já foi isolada a partir de amostras biológicas de um elevado número de outras espécies animais, domésticas e selvagens. Mycobacterium bovis (M. bovis) é o agente etiológico da tuberculose bovina. À semelhança de MAP, também o isolamento de M. bovis já foi reportado num elevado número de hospedeiros, incluindo animais domésticos e selvagens. Na Península Ibérica, o veado e o javali estão identificados como reservatórios de M. bovis em determinadas áreas geográficas de elevada prevalência, tendo um importante papel no ciclo epidemiológico da doença. Neste trabalho, pretendeu-se contribuir para o estudo da epidemiologia da paratuberculose e da tuberculose animal em Portugal, através da vigilância molecular e microbiológica de populações silvestres rastreadas de forma oportunística. Realizou-se a pesquisa de MAP e M. bovis em amostras biológicas de carnívoros, veados e javalis, doadas para fins científicos por várias entidades, e provenientes de atropelamento acidental, ações cinegéticas recreativas ou de correção de densidade de predadores devidamente autorizadas em Portugal continental. Cento e trinta e quatro amostras de fezes e 149 amostras de baço, provenientes de 225 animais silvestres, foram rastreadas para a presença de MAP. Os espécimes testados pertenciam a sete espécies diferentes, nomeadamente, sacarrabos (n=149), raposa (n=40), geneta (n=5), fuinha (n=4), texugo (n=4), javali (n=2) e veado (n=21). As matrizes biológicas utilizadas foram processadas para realização de cultura em meio Herrold‟s com e sem micobactina J, e para extração de DNA. O DNA extraído foi testado para a presença da sequência de inserção IS900, específica de MAP, através de nested PCR em tempo real. A presença da sequência IS900 foi detetada em amostras provenientes de 19 dos animais testados (8,4%; 95%CI: 5,47-12,8%), evidenciando a sua exposição àquele agente. Os animais positivos incluem nove sacarrabos, quatro raposas, uma fuinha, uma geneta, um javali e três veados, originários de várias localizações geográficas. A percentagem de animais positivos das espécies sacarrabos e raposa foi de 6,0% (95%IC: 3,2-11%) e 10% (95%IC: 4,0-23%), respetivamente. A deteção de MAP em veados sugere a existência de uma fonte ambiental e transmissão indireta, possivelmente através da existência de água e/ou vegetação contaminada com MAP, sendo que a identificação do microorganismo em amostras de carnívoros e javalis também sugere a possibilidade de contaminação do ambiente ou das presas, nas localizações geográficas de onde eram oriundos os animais positivos. Tendo em consideração a informação disponível na literatura, este é o primeiro estudo onde é detetada a presença de DNA de MAP em genetas. A deteção de DNA de MAP em animais provenientes de norte a sul de Portugal, também representa uma nova informação, uma vez que todos os dados publicados até ao momento, se reportam a animais selvagens oriundos da região centro e nordeste do país. Registou-se a deteção do DNA de MAP em ambas as matrizes biológicas, tratando-se este do primeiro estudo em que é reportada a deteção de MAP em fezes de animais selvagens. A deteção do microrganismo nas fezes sugere a sua excreção, que na forma viável poderá promover a continuação do ciclo infecioso. A análise estatística dos resultados evidenciou uma associação significativa (p<0,05) entre os animais positivos para a presença de MAP e a sua localização geográfica, sendo Faro, Aveiro e Viana do Castelo, os distritos com maior risco. Por outro lado, para as variáveis espécie, género, classe etária e tipo de matriz biológica analisada, não foram obtidas diferenças estatisticamente significativas. A caracterização molecular das amostras MAP-positivas foi realizada através da análise de MIRU-VNTR. Apesar de ter sido realizada uma otimização do protocolo aplicado, não foi possível obter um perfil alélico completo para nenhuma das amostras em análise. Contudo, alguns alelos foram observados pela primeira vez, e alelos múltiplos foram detetados para o VNTR X3, 7, 10, 25 e 292, o que pode ser explicado pela presença de uma co-infeção e/ou ser devido a uma mutação nos referidos loci. Registou-se ainda pela primeira vez a ocorrência de quatro alelos para o VNTR X3. Relativamente à pesquisa de M. bovis, foram analisadas 23 amostras de fezes e 98 amostras de fígado, provenientes de 121 animais. Os animais utilizados pertenciam a cinco espécies diferentes, especificamente sacarrabos (n=93), raposa (n=4), fuinha (n=1), javali (n=2) e veado (n=21). A metodologia seguida foi semelhante à aplicada para a pesquisa de MAP, contudo neste caso as matrizes biológicas utilizadas foram processadas para realização de cultura em meio Lowenstein-Jensen com piruvato e Stonebrink, e o DNA extraído foi testado através de uma abordagem de PCR em tempo real semi-nested para a presença da sequência de inserção IS6110, a qual é específica para os membros do complexo Mycobacterium tuberculosis. M. bovis foi isolada a partir de uma amostra de fezes de um veado, proveniente do distrito de Castelo Branco, uma área geográfica pertencente à zona epidemiológica de risco definida pelas autoridades Portuguesas para a tuberculose em caça maior. Nenhuma das restantes amostras em estudo demostrou ser positiva por cultura ou PCR. O presente estudo vem também alargar o conhecimento sobre os genótipos de M. bovis e M. caprae que circulam em Portugal, e das relações epidemiológicas entre as diferentes espécies de hospedeiros, através da caraterização molecular de 127 isolados por spoligotyping. Os isolados utilizados (117 de M. bovis e 10 de M. caprae) encontravam-se depositados no biobanco do INIAV, e são provenientes de animais selvagens (veado e javali) e domésticos (bovinos, caprinos e suínos). A elevada diversidade de estirpes existente em Portugal é confirmada, tendo sido obtidos 27 perfis distintos e um bom poder de discriminação do método (D=0,91). O spoligotipo mais frequente entre os isolados de M. bovis foi SB1174 (23%), enquanto SB0157 foi o único perfil obtido para todos os isolados de M. caprae. Quatro novos spoligotipos (SB2354-SB2357) foram identificados neste trabalho e adicionados à base de dados internacional (http://www.Mbovis.org). Os spoligotipos SB1269, SB1265, SB1375, SB0948 e SB1060 foram obtidos pela primeira vez em Portugal. Oito dos spoligotipos identificados (SB1174, SB1264, SB0122, SB0265, SB1266, SB1195, SB0295 e SB1483) são comuns a javalis e veados, e à exceção do SB1483, os animais compartilham a mesma origem geográfica, sugerindo uma fonte comum de infeção nestas áreas. Apesar das limitações inerentes a uma amostragem oportunística, o cálculo dos índices de diversidade Shannon-Wiener, Simpson e Berger-Parker, que combinam Informação sobre a ruiqueza e abundância de espécies, e dos estimadores não paramétricos de riqueza de espécies, chao 1 e chao 2, evidenciaram que, apesar do esforço de amostragem poder ser melhorado, o painel de espécies e número de espécimes incluídos neste estudo são adequados aos objetivos delineados, possibilitando inferências epidemiológicas acerca dos agentes patogénicos rastreados, particularmente no caso de MAP. Concluindo, a paratuberculose e tuberculose bovina são doenças com elevado impacto ao nível da saúde animal e da economia. As micobactérias patogénicas responsáveis por estas doenças circulam em animais domésticos e selvagens em Portugal continental, reforçando assim a necessidade de uma maior vigilância e revisão das medidas de controlo, de modo a favorecer a erradicação das mesmas.Paratuberculosis and bovine tuberculosis (bTB) are important infectious diseases of cattle caused by pathogenic mycobacteria, whose control present a challenge to livestock producers and veterinary authorities. These diseases represent a major problem for animal health and cause substantial economic losses associated with decreased productivity, limitations on animal trade and transactions of animal products, and slaughtering of infected animals in the case of bTB. Moreover, due to the zoonotic potential of these mycobacteria, and although the association of the paratuberculosis agent and Crohn's disease in humans is still ambiguous, it is necessary to strengthen the knowledge of the epidemiology of bTB and paratuberculosis, particularly the genetic signatures of the pathogens, their hosts, their routes of transmission and pathogenesis. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is responsible for causing paratuberculosis or Johne's disease, a chronic infection of the gastrointestinal tract that affects ruminants worldwide. Ruminants appear to be the preferred or natural host, but MAP has already been isolated from other animal species, both domestic and wild. Mycobacterium bovis (M. bovis) is the causative agent of bovine tuberculosis. Besides cattle, M. bovis can infect other domestic and wild species. In Iberian Peninsula, red deer and wild boar are known to act as maintenance hosts for M. bovis in hotspot areas. In this work, the occurrence of MAP and M. bovis in wild carnivores, wild boar and red deer was assessed based on the molecular screening and microbiological culture of tissue samples opportunistically obtained from road-killed or hunted animals in mainland Portugal. MAP detection was performed in feces and spleen samples from 225 animals, belonging to seven different species, namely Egyptian mongoose (n=149), red fox (n=40), common genet (n=5), stone marten (n=4), European badger (n=4), red deer (n=21) and wild boar (n=2), collected between 2005 and 2015. Samples were tested by culture in Herrold‟s egg yolk solid medium, supplemented with and without mycobactin J, and by nested real-time PCR to amplify IS900 MAP-specific sequence. The occurrence of MAP-positive animals, detected exclusively by PCR, was 8,4% (95%CI: 5,47-12,8%), which included nine Egyptian mongoose, four red fox, one stone marten, one common genet, one wild boar and three red deer, from several geographic locations. The percentages of MAP-positive Egyptian mongoose and red fox were 6,0% (95%CI: 3,2-11%) and 10% (95%CI: 4,0-23%), respectively. The detection of MAP-positive red deer suggests an environmental source and indirect transmission, possibly indicating the presence of MAP-contamined water/pasture; while the identification of MAP-positive carnivores and wild boar also suggest contamination of the environment and/or ingestion of infected prey. To our knowledge, MAP circulation in genets is reported for the first time. The presence of MAP-positive animals in several geographic locations, from north to the south of Portugal, also represents new data, since all the information published so far on wildlife is limited to animals from the center and northeast regions of mainland Portugal. MAP DNA was detected in both biological matrices under study, being this survey the first report of MAP DNA in feces from wildlife. These results suggest contamination of the surrounding environment promoting the continuation of the infectious cycle. The statistical analysis to identify risk factors for MAP exposure showed a significant association (p<0,05) between MAP-positive animals and their geographical location, being Faro, Aveiro and Viana do Castelo, the districts with increased risk. Other variables like species, gender, age class and type of organic matrix, were also analyzed, but no statistically significant differences were obtained. Genotyping of MAP-positive samples was performed through MIRU-VNTR analysis, and, although several optimization approaches were attempted, it was not possible to obtain a complete allelic profile for any of the positive samples. Despite this fact, some alleles are reported for the first time, and multiple alleles were detected in VNTR X3, 7, 10, 25 and 292, which suggest co-infection with more than one MAP strain and/or mutation in these particular loci. Moreover, the occurrence of four alleles in VNTR X3 was registered for the first time. The exposure to M. bovis was tested in feces and liver samples of 121 animals from five different species, namely Egyptian mongoose (n=93), red fox (n=4), stone marten (n=1), wild boar (n=2), and red deer (n=21) collected in 2012, 2013 and 2015, by culture in Lowenstein-Jensen pyruvate and Stonebrink solid media and using a semi-nested real-time PCR approach targeting IS6110. M. bovis was isolated from one red deer from Castelo Branco, a geographic area enclosed in the epidemiological risk area for bovine tuberculosis in big game animals. None of the other samples under analysis was positive by culture or PCR. The molecular characterization of M. bovis and M. caprae isolates from the bio-bank of INIAV was performed, by spoligotyping, disclosing the genetic diversity of 117 M. bovis and 10 M. caprae strains from domestic (cattle, sheep and pig) and wild animals (wild boar and red deer) isolated between 2011 and 2015. Spoligotyping exhibited a good discriminatory power (D=0,91) for the strains, revealing 27 different patterns. SB1174 was the most common spoligotype, accounting for 23% of the M. bovis isolates; and SB0157 was the only pattern obtained for M. caprae. Four new spoligotypes (SB2354-SB2357) were identified and deposited in the international M. bovis database (http://www.Mbovis.org). The patterns SB1269, SB1265, SB1375, SB0948 and SB1060 were obtained for the first time in Portugal. Eight patterns (SB1174, SB1264, SB0122, SB0265, SB1266, SB1195, SB0295 and SB1483) were common to wild boar and red deer and, with the exception of SB1483, the animals share the same geographical location, suggesting a common source of infection in those areas. Despite the constraints related to our opportunistic sample, calculation of the diversity indices Shannon-Wiener, Simpson and Berger-Parker, combining information about species richness and abundance, and of the non-parametric estimators of species richness, chao 1 and chao 2, evidenced that, although sampling efforts could be reinforced, the panel of sampled species and number of specimens included was adequate for the purposes of this study, enabling inference of the epidemiological situation for the pathogens surveyed, particularly in the case of MAP.Results from this work thus confirm that MAP and M. bovis circulate in livestock and widely distributed wildlife species from specific geographic regions of mainland Portugal and suggest the possibility of environmental contamination, reinforcing the need for increased surveillance and adjustment of control measures in order to enable successful eradication of these relevant diseases