Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015Com a identificação e o estudo do gene humano tbccd1, foi identificada uma proteína, a TBCCD1, por ele codificada. Esta proteína foi então descrita como sendo uma proteína centrossomal, que se localiza também nos corpos basais de cílios primários e no corpo médio. Foram identificados dois novos transcritos do tbccd1 resultantes de splicing alternativo, nomeadamente, variante 2 e variante 3, sendo que o transcrito variante 1 codifica a proteína TBCCD1 variante 1 inicialmente descrita.
O knockdown do tbccd1 utilizando siRNAs provoca vários fenótipos em células hTERT RPE-1, como o aumento da distância centrossoma-núcleo, a fragmentação do complexo de Golgi e a diminuição na velocidade de migração em ensaios de fecho da ferida.
Assim, este trabalho teve como principal objetivo o estudo da função biológica de cada uma das variantes identificadas.
Estudou-se a localização celular de cada uma das variantes identificadas em diferentes linhas celulares humanas. Observou-se que as proteínas TBCCD1 variante 2 e TBCCD1 variante 3 têm uma localização citoplasmática em todas as situações analisadas. Pelo contrário, como tinha já sido observado, a proteína TBCCD1 variante 1 localiza-se no centrossoma, no corpo médio e nos corpos basais de cílios primários. Curiosamente, observou-se que a localização desta proteína no corpo médio é dependente dos microtúbulos, ao contrário do que acontece com a sua localização centrossomal. Esta observação sugere então uma interação com microtúbulos do corpo médio onde existe uma acumulação de microtúbulos acetilados.
Observou-se também que a sobre expressão das proteínas TBCCD1 variante 1 ou TBCCD1 variante 2 provoca uma diminuição nos níveis de α-tubulina acetilada, assim como de γ-tubulina e de β-actina. Já a sobre expressão da proteína TBCCD1 variante 3 não parece afetar os níveis dos componentes do citoesqueleto analisados.
Estudou-se também se o fenótipo do aumento da distância centrossoma-núcleo pode ser provocado por apenas uma das variantes ou resulta da ação combinada de mais do que uma variante. Para isso, realizaram-se ensaios de recuperação do fenótipo, tendo-se observado que as proteínas TBCCD1 variante 1 e TBCCD1 variante 2 revertem parcialmente o fenótipo em estudo.
Para além disso, realizou-se um estudo recorrendo a RT-qPCR no qual se observou que as variantes têm uma função de regulação entre si. A sobre expressão das proteínas TBCCD1 variante 1 ou TBCCD1 variante 2 leva À alteração dos níveis dos transcritos das variantes 1, 2 e 3. Já a sobre expressão da proteína TBCCD1 variante 3 afeta apenas os níveis do transcrito variante 3 endógeno.
Em conjunto, os resultados obtidos neste estudo indicam que as proteínas codificadas pelos três transcritos identificados deverão ter diferentes funções celulares. Para além disso, as proteínas TBCCD1 variante 1 e TBCCD1 variante 2 afetam os níveis de α-tubulina acetilada, γ-tubulina e β-actina, o que pode afetar, por exemplo, a organização do complexo de Golgi e a migração celular, através da regulação da dinâmica dos microtúbulos. Assim, estes resultados contribuem de forma decisiva para a compreensão dos fenótipos observados nas experiências do knockdown do tbccd1.When the human gene tbccd1 was identified and studied, a protein, TBCCD1, that it encoded was also identified. This protein was then described as a centrossomal protein that also localizes at the basal bodies of primary cilia and to the midbody. Two new transcripts of tbccd1 originated by alternative splicing were identified, namely, variant 2 and variant 3, and it is now known that variant 1 encodes the TBCCD1 protein initially described.
The knockdown of tbccd1 using siRNAs causes several phenotypes in hTERT RPE-1 cells, such as the increase in centrosome-nucleus distance, fragmentation of the Golgi apparatus and a decrease of the cell migration in wound healing assays.
The main goal of this work was to study the biological function of each of the identified tbccd1 variants.
In this study, the cellular localization of each of the variants in different human cell lines was accessed. TBCCD1 variant 2 and TBCCD1 variant 3 proteins have a cytoplasmic localization in all the situations analyzed. As it has already been described, TBCCD1 variant 1 protein localizes at the centrosome, the basal bodies of primary cilia and to the midbody. Interestingly, it was shown that the midbody localization of this protein is dependent on microtubules, while its centrossomal localization is not. This observation suggested an interaction of this protein with a population of microtubules in the midbody where they are highly acetylated.
Overexpression of TBCCD1 variant 1 or TBCCD1 variant 2 causes a decrease on acetylated α-tubulin levels, and also on γ-tubulin and β-actin levels. The overexpression of TBCCD1 variant 3 does not seem to affect the levels of any of the cytoskeleton components analyzed.
It was also studied if the increased centrosome. Nucleus distance phenotype is caused by only one or a combination of the identified variants. In order to do this, we performed phenotype rescue assays, and it was shown that overexpression of TBCCD1 variant 1 or TBCCD1 variant 2 can partially rescue this phenotype.
Moreover, we used RT-qPCR to study whether the identified variants have a regulatory function between them, and showed that TBCCD1 variant 1 or TBCCD1 variant 2 overexpression affects the levels of the three transcripts. On the other hand, the overexpression of TBCCD1 variant 3 only affects variant 3 endogenous transcript levels. Taken together, the results obtained in this study indicate that the proteins encoded by the three transcripts might have different cellular functions. Furthermore, TBCCD1 variant 1 and TBCCD1 variant 2 affect acetylated α-tubulin, γ-tubulin and β-actin levels which may be implicated on, for example, Golgi apparatus organization and cell migration by the regulation of microtubules dynamics. Therefore, this results contributed to the comprehension of the causes of the tbccd1 knockdown phenotypes
