Tese de mestrado em Química, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A descoberta de novos antibióticos que apresentem mecanismos de ação inovadores representa um dos principais desafios que a comunidade científica enfrenta, sobretudo devido à disseminação crescente de estirpes bacterianas resistentes às terapêuticas disponíveis. Neste contexto, o nosso grupo de investigação está particularmente interessado em explorar a potencial utilidade terapêutica de surfactantes derivados de açúcares enquanto agentes antibacterianos. Estas moléculas são conhecidas pela sua biocompatibilidade e por apresentarem baixa toxicidade ecológica, pelo que se consideram apropriadas para aplicações em medicina e na indústria. Em trabalhos anteriores, descrevemos uma série de 2-desoxi-/2,6-didesoxi-arabino-hexopiranósidos de alquilo [1–3], alguns dos quais exibiram actividades antibacterianas potentes e seletivas quando testadas em estirpes de Bacillus, nomeadamente B. cereus, B. subtilis e, em particular, B. anthracis, sendo o último considerado um agente de bioterrorismo. No entanto, o composto mais potente, 2,6-didesoxy-arabino-hexopiranósido de dodecilo, revelou também induzir toxicidade aguda em linfócitos humanos. Assim, considerámos relevante proceder com a otimização desta estrutura, perspectivando, por um lado, vir a alcançar um candidato a fármaco potencialmente não tóxico e, por outro, aprofundar o nosso conhecimento no que diz respeito às características estruturais que determinam a sua bioactividade. Os dados por nós obtidos sobre a actividade superficial destes compostos, bem como estudos biológicos preliminares que realizámos, sugerem um mecanismo de ação que deverá envolver a associação de glicósidos em agregados micelares em solução e a interação destas estruturas com as membranas celulares bacterianas, de forma
semelhante à acção de detergentes. No entanto, as interações moleculares que conduzem a estes fenómenos ainda não foram elucidadas. Neste trabalho, procurámos contribuir para esta investigação em curso por via de uma abordagem interdisciplinar, nomeadamente através do (i) design, síntese e subsequente avaliação da actividade antibacteriana de desoxiglicósidos análogos ao composto líder, e de um (ii) estudo computacional centrado na interação dos mesmos compostos com um modelo de bicamada lipídica. O racional para a síntese de novos desoxiglicósidos de dodecilo relationados com o composto líder foi concebido com o intuito de explorar o eventual impacto biológico de modificações estruturais específicas, nomeadamente a substituição de um átomo de hidrogénio na posição 2 do açúcar por um grupo hidroxilo (para a formação de um 6-desoxiglicósido) ou por um átomo de flúor (para a formação de 2,6-didesoxi-2-fluoroglicósidos) e, em alternativa, a substituição de grupo metilo na posição 6 por um átomo de hidrogénio (para a formação de 2-desoxipentopiranósidos). Por conseguinte, a sua preparação envolveu necessariamente estratégias distintas. A síntese de _-l-rhamnopiranósido de dodecilo (6-desoxi-_-l-mannopiranósido de dodecilo) foi conseguida através da glicosilação estereoseletiva do precursor tricloroacetimidato peracetilado (que foi
obtido de forma simples e eficiente a partir da l-rhamnose, em três passos) catalizada pelo triflato de trimetilsililo, seguida de uma reação de desacetilação (rendimento de 85% para os
dois passos). Os compostos-alvo desoxigenados e/ou fluorados na posição 2 do açúcar, por sua
vez, foram preparados utilizando glicais como materiais de partida. Assim, novos 2-desoxi-e-l-threo-pentopiranósidos de dodecilo foram também sintetizados, desta vez por via da reação
do l-xilal peracetilado (obtido a partir da l-xilose em três passos por via de metodologias convencionais) com dodecanol catalisada por hidrobrometo de trifenilfosfónio e subsequente reacção de desproteção. A reação de glicosilação originou os correspondentes anómeros _ e _ com rendimentos de 23% e 10%, respectivamente, e foram ainda isoladas quantidades consideráveis de glicósidos 2,3-insaturados (rendimento total de 27%), que se formam por rearranjo alílico e concomitante eliminação de ácido acético em meio ácido. Esta metodologia merece pois optimização futura com vista a promover a conversão selectiva dos intermediários saturados, por exemplo através da utilização de éteres benzílicos como grupos protetores uma vez que estes são em geral mais estáveis em meio ácido. Curiosamente, verificou-se que o anómero _ assume um comportamento conformacional atípico, dependendo do solvente, que foi possível racionalizar combinando análise por NMR e cálculos quânticos (DFT). Finalmente, preparámos vários 2,6-didesoxi-2-fluoroglicósidos de dodecilo através da fluoração eletrófila e simultânea adição nucleófila de dodecanol a derivados protegidos do 6-desoxi-l-glucal, que ocorrem na presença de selectfluor, e subsequente reação de desproteção. Quando a reação foi conduzida usando o glical peracetilado, disponível comercialmente, obtiveram-se os glicósidos exibindo configuração _-l-gluco e _-l-manno com um rendimento de 37% (sob a forma de uma mistura inseparávelde epímeros), e o glicósido exibindo configuração _-l-gluco com um rendimento de 5%. Por sua vez, a reação a partir do glical sililado (que foi previamente sintetizado partindo do glical acetilado correspondente por desacetilação e subsequente sililação, num único passo) promoveu a formação preferencial dos estereoisómeros exibindo configuração gluco, tendo sido isolados os _-l-gluco- e _-l-gluco-glicósidos com um rendimento de 27% (desta vez sob a forma de uma mistura inseparável de anómeros), e o _-l-manno-glicósido com um rendimento de 7%. No que diz respeito à actividade antibacteriana destes compostos, quando determinada pelo método de diluição em meio líquido, verificou-se que o 6-desoxiglicósido e os 2-desoxipentopiranósidos apresentam actividades moderadas quando testados contra B. cereus (CMI = 32 μg mL-1). Por outro lado, os 2,6-didesoxi-2-fluoro-_-l-glicósidos revelaram ser os compostos mais activos, apresentando uma actividade antibacteriana competitiva com a exibida pelo composto líder (CMI = 16 μg mL-1), enquanto que o estereoisómero _-gluco não foi de todo activo na gama de concentrações testada. Alguns dos compostos sintetizados, nomeadamente aqueles que não apresentam um átomo de flúor na sua estrutura, foram ainda testados no que se refere à inibição de B. anthracis, neste caso utilizando o método de diluição em meio sólido. Verificou-se que todos estes compostos são inibidores potentes deste agente patogénico e, por consequência, consideramos particularmente relevante a sua potencial aplicação também no contexto da
segurança biológica. As simulações de dinâmica molecular têm sido bastante utilizadas enquanto método para explorar as propriedades estruturais e dinâmicas de uma variedade de sistemas amfifílicos, incluindo micelas de surfactantes e bicamadas lipídicas, assim como para investigar fenómenos intermoleculares importantes, tais como interações fármaco-membrana. Neste contexto, realizámos um estudo de dinâmica molecular com o objectivo de estudar esta família de desoxiglicósidos de alquilo, incluindo alguns dos sintetizados no âmbito desta dissertação, na perspectiva contribuir para a elucidação do seu mecanismo de ação. Os nossos resultados confirmam que estes glicósidos formam micelas estáveis em solução aquosa, em concordância com os dados experimentais que se conhecem relativamente à sua actividade superficial. Verificou-se ainda que essas micelas interagem fortemente com um modelo de membrana na sua vizinhança, tendo sido observados vários eventos de partição e/ou fusão micela-membrana, indicando uma preferência clara para a fase lipídica. Também foi estudado o efeito destas moléculas sobre uma bicamada lipídica, em função da sua concentração. Este estudo demonstrou que tanto a ordem das cadeias hidrocarbonadas dos fosfolípidos como a espessura da bicamada aumentam quando a concentração de glicósido é aumentada. Estas alterações biofísicas, que correspondem a uma eventual diminuição da fluidez membranar, poderão ter um impacto significativo na integridade estrutural de uma membrana biológica. Consideramos portanto este resultado particularmente importante, uma vez que estudos preliminares por nós realizados sugerem que o mecanismo de ação destes glicósidos surfactantes não deverá envolver a formação/estabilização de poros membranares. Em suma, o trabalho realizado demonstra que esta família de desoxiglicósidos inclui vários compostos que apresentam actividades antibacterianas muito potentes e cujo mecanismo de acção deverá ser diferente daqueles que se conhecem para outras classes de antibióticos. Sugerimos
pois um mecanismo baseado na ordenação dos fosfolípidos de membrana como consequência da partição de glicósidos.The search for new antibiotics with innovative mechanisms of action represents a foremost challenge to the scientific community owing to the increasing spread of bacterial resistance to the available therapeutics. In this context, our research group is particularly interested in exploiting the potential usefulness of sugar-based surfactants as antibacterial agents. These molecules are known for their biocompatibility properties and feature low ecotoxicity, making them suitable for several industrial and medicinal applications. In previous work, we reported a series of alkyl 2-deoxy-/2,6-dideoxy-arabino-hexopyranosides [1–3], some of which exhibited potent and selective antibacterial activities against Bacillus cereus, Bacillus subtilis and, particularly, Bacillus anthracis, which is considered a bioterrorism agent. However, the most potent compound, dodecyl 2,6-dideoxy-_-l-arabino-hexopyranoside, was also shown to induce acute toxicity towards human lymphocytes. Hence, we were motivated to further optimize this structure with the intent to achieve a potentially non-toxic drug candidate, and to better understand the structural determinants governing bioactive profile. The available data on the surface activity of these compounds and preliminary biological studies suggest a mechanism of action involving aggregation of glycosides into micelles and their interaction with bacterial cell membranes in a detergent-like manner. However, the molecular interactions driving this phenomena are yet to be unraveled. In this research work, we present an interdisciplinary approach to this ongoing investigation, based on (i) the design, synthesis and antibacterial evaluation of deoxy glycoside analogues, and (ii) a computational study focused on their interactions with a model lipid bilayer. The rationale for design of new dodedyl deoxy glycosides related to the lead compound was conceived aiming at exploring the biological impact of specific structural modifications, namely the replacement of one hydrogen atom at 2-position of the sugar moiety by a hydroxy group (i.e. 6-deoxy glycoside) or by a fluorine atom (i.e. 2,6-dideoxy-2-fluoro glycoside) and, alternatively, the replacement of the methyl group at 6-position by a hydrogen atom (i.e. 2-deoxy pentopyranoside). Accordingly, their preparation was accomplished following distinct approaches. The synthesis of dodecyl _-l-rhamnopyranoside (dodecyl 6-deoxy-_-l-mannopyranoside) succeeded through stereoselective glycosylation of the peracetylated trichloroacetimidate precursor (prepared from l-rhamnose in three steps) catalyzed by trimethylsilyl triflate, followed by deacetylation (85% yield over two steps). Target compounds deoxygenated and/or fluorinated at 2-position of the sugar, in turn, were prepared using glycals as starting materials. New dodecyl 2-deoxy-_- and _-l-threo-pentopyranosides were synthesized by reaction of peracetylated l-xylal (obtained from l-xylose in three steps) with dodecanol catalyzed by triphenylphosphane hydrobromide and subsequent deprotection. The glycosylation reaction gave the _- and _-anomers in 23% and 10% isolated yields, respectively, and considerable amounts of 2,3-unsaturated glycosides, arising from acid-catalyzed allylic rearrangement, were also isolated (27% yield). Interestingly,
an unusual, solvent-dependent conformational behaviour was found to be assumed by the
_-glycoside, as rationalized by combined NMR analysis and DFT calculations. Finally, dodecyl
2,6-dideoxy-2-fluoro glycosides were accessed by one-pot electrophilic fluorination/nucleophilic addition of dodecanol to protected 6-deoxy-l-glucal derivatives mediated by selectfluor, followed by deprotection. Reaction with the readily available acetylated glycal gave the _-l-gluco- and _-l-manno-glycosides in 37% yield (inseparable mixture), and the _-l-gluco-glycoside in 5% yield. When the silylated glycal (prepared from the corresponding acetylated glycal by onepot deacetylation and silylation) was employed, improved gluco-stereoselectivity was achieved, affording the _-l-gluco- and _-l-gluco-glycosides in 27% yield (inseparable mixture), and the _-l-manno-glycoside in 7% yield. With regard to the antibacterial activity using the broth dilution method, the 6-deoxy glycoside and 2-deoxy pentopyranosides were moderately active towards B. cereus (MIC = 32 μg mL-1). The 2,6-dideoxy-2-fluoro-_-l-glycosides were the most active compounds, presenting antibacterial activity competitive with that of the lead compound (MIC = 16 μg mL-1), whereas the _-gluco-stereoisomer was not active in the range of concentrations tested. The non-fluorinated compounds were further tested against B. anthracis, using the agar dilution method, and have been proven to be potent inhibitors of this pathogen (MIC = 8-16 μg mL-1), highlighting their potential in the context of biosecurity as well. Molecular dynamics (MD) simulations have been widely employed to explore the structural and dynamic properties of a variety of amphiphilic systems, including surfactant micelles and lipid bilayers, as well as to probe relevant intermolecular phenomena such as drug-membrane interactions. Hence, we performed a MD study for this family of alkyl deoxy glycosides, including some of the newly synthesized compounds, looking for insights into their mechanism of action. Our results confirm that these glycosides form stable micelles in solution, in agreement with experimental data on their surface activity. The micelles were shown to interact strongly with a membrane model, and several partition and/or fusion events were observed, indicating a clear preference for the lipidic phase. The direct concentration-dependent effect of these glycosides in the lipid bilayer was also studied, which revealed an increase in the phospholipid hydrocarbon chain ordering, as well as in the membrane thickness. These biophysical alterations, corresponding to a possible decrease in membrane fluidity, may have a significant impact on the structural integrity of a biological membrane. This is particularly relevant since our preliminary results suggest that membrane pore formation/stabilization is not likely to be involved in the mechanism of action for these sugar-based surfactants. In summary, this work shows that this family of deoxy glycosides comprises very potent membraneactive antibacterial compounds which do not seem to exert their action through commonly known mechanisms. Instead, we suggest a mechanism relying on membrane ordering and stiffening, upon partitioning of these compounds
