Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Microbiologia e Parasitologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014Malaria and tuberculosis (TB) endemic regions overlap considerably, especially in sub-Saharan Africa. Although it is very likely that co-infections occur in these regions, not much is known about malaria-TB co-infections in humans, and how the interplay between these two infections might affect the prognosis of co-infected individuals. Furthermore, multiple Plasmodium infections will likely result in accumulation of malaria pigment (hemozoin) in host organs. Hemozoin was first thought of as an inert waste product resulting from hemoglobin digestion. However, several studies have associated the presence of hemozoin with host immunosuppression. Thus, the subject of this thesis was the study of Malaria-Tuberculosis co-infections with a particular focus on a possible role for hemozoin induced immunosuppression. For this, protocols for hemozoin production and characterization were first established. Then, in vitro studies to investigate how hemozoin ingestion affected cellular functions of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were performed. For the first time hemozoin effects at the single cell level were investigated by flow-cytometry, using a novel method developed by us, which uses Side Scatter Depolarization for hemozoin detection. Following in vitro studies, we investigated hemozoin dynamics in host tissues of two murine models, post-malaria clearance. Hemozoin deposition in host organs was evaluated both by flow-cytometry, as well as by observation of histological preparations. Finally, the murine model was used to evaluate the susceptibility of Plasmodium infected mice to subsequent tuberculosis infection. Tuberculosis infection was evaluated during acute malaria, and during chronic Plasmodium infection. Results from in vitro studies suggested that hemozoin impaired cell functions and that these effects could be propagated to non-hemozoin containing cells. Hemozoin-induced impairment decreased microbicidal activity, as shown by higher mycobacterial load in these cells. Our investigation of hemozoin kinetics in host organs revealed that hemozoin is dynamic within and between host organs, with very little signs of it being eliminated over time. Malaria-tuberculosis co-infection in vivo demonstrated that mice presenting with acute malaria, have a poor prognosis when co-infected with tuberculosis. Mice infected with tuberculosis during chronic malaria did not become as sick as mice during acute infection however, they still exhibited symptoms of malaria-induced anaemia. Thus, in our model of co-infection hemozoin did not seem to contribute significantly to immunosuppression of the host nor to increased susceptibility to tuberculosis infection. Overall, we present a novel method for the detection of hemozoin that allowed functional investigation of hemozoin-containing and non-hemozoin containing leukocytes at the single cell level, in the same sample. This might be useful for further studies using leukocytes from malarious patients, who usually only have a few percent of these cells in circulation. We also provide evidence for poor prognosis of malaria-tuberculosis co-infection. Furthermore, we demonstrated that following a malaria episode, hemozoin deposition in host organs did not seem to contribute to immunosuppression of the host nor to increased susceptibility to tuberculosis infection by M. bovis BCG. However, we observed that hemozoin-containing macrophages participated in granuloma formation in response to tuberculosis infection. This might prove relevant in the context of a tuberculosis infection by the virulent strain M. tuberculosis, in which tighter control by immune cells is necessary to prevent tuberculosis dissemination.As regiões endémicas da malária e tuberculose sobrepõem-se consideravelmente, especialmente na África sub-Saariana. Embora seja bastante provável que co-infecções entre malária e tuberculose ocorram nestas regiões, pouco se sabe sobre a sua incidência, ou como a sua interação poderá afectar o prognóstico de indivíduos co-infectados. Episódios consecutivos de malária poderão levar à acumulação do pigmento malárico (hemozoína) nos órgãos do hospedeiro. Inicialmente, a hemozoína era considerada um sub-produto inerte, resultante da digestão da hemoglobina pelo parasita. No entanto, vários estudos têm associado a presença da hemozoína com imunossupressão do hospedeiro. Assim, o tema desta tese foi o estudo da co-infecção malária-tuberculose, com especial foco no possível papel da hemozoína na indução de imunossupressão no hospedeiro. Neste projecto, começou por estabelecer-se protocolos para produção e caracterização de hemozoína. Consequentemente, foram realizados estudos in vitro para investigar o impacto da ingestão de hemozoína nas funções celulares de células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) humanos. Pela primeira vez, os efeitos da hemozoína foram investigados por citometria de fluxo, utilizando um novo método desenvolvido por nós, que utiliza a detecção da despolarização da luz para a identificação de células que contêm hemozoína. Após esta caracterização in vitro, a dinâmica da hemozoína em tecidos do hospedeiro após a infecção por Plasmodium foi investigada, usando dois modelos de ratinho. A acumulação de hemozoína em órgãos do hospedeiro foi avaliada por citometria de fluxo, e pela observação de preparações histológicas, ao longo do tempo. Finalmente, o modelo de murino foi usado para avaliar a susceptibilidade de ratinhos com malária a uma subsequente infecção por tuberculose. A infecção por tuberculose foi avaliada durante as fases aguda e crónica de malária. Os resultados dos estudos in vitro sugerem que a hemozoína compromete funções celulares importantes e que estes efeitos podem ser propagados a células que não têm hemozoína. A inibição de funções celulares levou à redução da capacidade microbicida, como mostrado pelo aumento da carga bacteriana nestas células. Relativamente à avaliação da cinética da hemozoína nos tecidos do hospedeiro, este estudo revelou que a hemozoína tem uma distribuição dinâmica tanto dentro do mesmo órgão, como entre IV diferentes órgãos do hospedeiro. Também se observou que, ao longo do tempo, a hemozoína não parece ser eliminada dos órgãos do hospedeiro. Os ensaios in vivo de co-infecção malária-tuberculose demonstraram que ratinhos com malária desenvolvem uma doença fulminante, quando co-infectados com tuberculose. Este fenótipo agravado não foi observado em ratinhos infectados com tuberculose durante uma infecção crónica de malária, ainda que estes apresentassem sinais de anemia associada à malária. Tendo em conta os resultados obtidos com o nosso modelo, a hemozoína não parece contribuir de forma significativa para a imunossupressão do hospedeiro nem para um aumento de susceptibilidade à infecção por tuberculose. Em resumo, este trabalho apresenta um novo método para a detecção de hemozoína. Este método permitiu a investigação de funções celulares em leucócitos com e sem hemozoína na mesma amostra, ao nível celular. Esta metodologia poderá ser aplicada noutros estudos, nomeadamente na análise de leucócitos com hemozoína de doentes com malária, cujas percentagens são normalmente baixas. Os resultados apresentados nesta tese também sugerem que co-infecções de malária-tuberculose resultam numa deterioração rápida do hospedeiro. No entanto, como observado durante a infecção crónica de malária, a deposição de hemozoína nos órgãos do hospedeiro não parece contribuir para um aumento da imunossupressão do hospedeiro, não tendo sido observada uma maior susceptibilidade à infecção por tuberculose. Ainda assim, foi observado que macrófagos com elevado conteúdo em hemozoína contribuem significativamente para a formação de granulomas, em resposta à infecção por M. bovis BCG. Isto pode ser relevante no contexto de uma infecção de tuberculose pela estirpe virulenta M. tuberculosis, em que é necessário um controlo mais restrito por células do sistema imunitário para prevenir a disseminação da tuberculose.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/61174/2009, projecto PIC/IC/83214/2007
