Tese de doutoramento, Ciências e Tecnologias da Saúde (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014There are large geographical and temporal variations in the frequency of macrolide-resistant Streptococcus pyogenes, as well in the associated resistance phenotypes. Although decreases in macrolide resistance were often associated with low macrolide consumption, natural fluctuations of macrolide resistant clones were also suggested to play an important role in the prevalence of resistant isolates and of resistance phenotypes. The recent report of heterogeneity found among group A streptococcus (GAS) isolates recovered from the same patient raised the question of whether the strategy used in the microbiology laboratory, the study of microorganisms from a single colony, was leading to the underestimation of macrolide resistance rate. For that purpose, 321 GAS isolates, recovered from 35 pharyngitis patients from one hospital were screened for potential differences in antimicrobial resistance profiles and emm types of up to 10 isolates recovered from the same sample. In our collection, all the isolates recovered from the same patient presented an identical antimicrobial resistance profile and emm type, indicating that the single colony approach was suitable for a correct identification of macrolide resistance rates and other epidemiological studies. In this thesis, the epidemiology of macrolide resistant GAS in Portugal is divided in 3 periods - 1998 to 2003, 2004 to 2006 and 2007 to 2011. In all periods, macrolide resistance rates and macrolide resistance phenotypes and genotypes were determined; molecular characterization of the resistant population was accomplished by T typing, emm typing, pulsed field gel electrophoresis (PFGE) profiling and multilocus sequence typing (MLST). In the first period, macrolide resistance was high (27%) and stable. However, this stability was accompanied by a variation in the prevalence of the resistance phenotypes. In just 6 years, there was a complete inversion in the prevalence of macrolide resistance phenotypes. The molecular characterization of 325 resistant isolates revealed a diverse population, and the genetic lineages identified in Portugal were also identified in other European countries; the most common were T12-emm22-ST46, T28-emm28-ST52, T4- emm4-ST39, T12-emm12-ST36 and T1-emm1-ST28. This unusual situation motivated continuing the surveillance studies. Results from the analysis of the isolates recovered in 2004-2006 allowed the identification of a decreasing trend in macrolide resistance that had started in 1999. The diversity in the clonal composition was still evident among the 156 isolates studied and, with minor exceptions, the same genetic lineages were identified, although differences in their prevalence were noted. Among the most prevalent lineages were T28-emm28-ST52, T4-emm4-ST39, T11-emm11-ST403, and T12-emm22-ST46. In order to determine if this decline in macrolide resistance was sustained, the susceptibility of isolates recovered in 2007-2011 was determined and the clonal composition of the resistant population (n=139) was analyzed. The results showed that macrolide resistance continued to decline, reaching in 2011 the lowest value ever recorded in Portugal (2%). Again, macrolide resistant genetic lineages had been previously described in Portugal and other countries, with some changes in their prevalence. The lineage defined by T11-emm11-ST403 was now the most prevalent, followed by T12-emm22-ST46, T12-emm12-ST36 and T28-emm28-ST52. One of the most intriguing observations was that this situation was paralleled by high macrolide consumption, emphasizing the critical role of the fluctuations in the resistant clones for the prevalence of resistance. Although a small group of resistant lineages has been shown to be widely disseminated, little is known about the reasons for their success and their origin - ongoing acquisition of macrolide resistance genes followed by local spread or simple geographic dissemination. In order to see if the macrolide resistant GAS population was mirroring the general pharyngeal population or if their dynamics were independent, a collection of 803 isolates, representing 50% of all isolates recovered from tonsillo-pharyngitis patients in Portugal from 2000 to 2005 was analyzed by all the typing methods mentioned above. This comparison allowed the identification of specific emm types and PFGE clones associated with each of the macrolide resistant phenotypes. Among the emm types found in this collection, emm4, emm22 and emm28 were associated with macrolide resistance and emm3, emm6, emm87 and emm89 with macrolide susceptibility. Furthermore, the usefulness of PFGE in typing S. pyogenes was reinforced with this work since it was the only method capable of differentiating macrolide resistant and susceptible isolates of the same emm types. Examples of this could be found in emm4 and emm1. Additionally, both populations presented different diversities indicating that macrolide resistant GAS has its own dynamics, independent of the changing patterns of the general population. The production of the exotoxins SpeA and SpeC was for a long time believed to be responsible for scarlet fever, one of the infections caused by S. pyogenes. However, the literature is contradictory and some studies failed to detect such associations. In order to find out any potential markers of this disease, we characterized a collection of 101 scarlet fever isolates and compared it with pharyngitis isolates (n=202) (these not associated with scarlet fever). To achieve this, the superantigen gene profile was determined for all isolates, in addition to the typing methods already mentioned. The results showed that ssa, speA and speC were associated with scarlet fever and that scarlet fever isolates are less diverse than the pharyngitis isolates, indicating that a restricted number of lineages have a higher propensity to cause this presentation.Existem grandes variações geográficas e temporais na frequência de estirpes de Streptococcus pyogenes resistentes aos macrólidos, assim como na prevalência dos respectivos fenótipos de resistência. Apesar de uma diminuição na resistência aos macrólidos ter sido frequentemente associada a um baixo consumo deste antibiótico, foi já sugerido um papel importante para as flutuações naturais dos clones resistentes aos macrólidos na prevalência de estirpes resistentes e dos seus fenótipos. Um estudo recente demonstrou a existência de heterogeneidade entre estirpes de estreptococos do grupo A (GAS) isoladas no mesmo doente, levantando a questão da validade de isolar e estudar uma só colónia a partir das placas primárias para a correcta determinação da resistência aos macrólidos. Para testar esta premissa, 321 estirpes de GAS, isoladas de 35 doentes do mesmo hospital, com um diagnóstico de faringo-amigdalite, foram estudadas de modo a detectar possíveis diferenças na susceptibilidade antimicrobiana e no tipo e subtipo emm. Nesta colecção, todas as estirpes isoladas do mesmo doente apresentaram o mesmo perfil de resistência aos antimicrobianos e o mesmo tipo e subtipo emm, indicando que a estratégia utilizada é adequada para uma correcta identificação da taxa de resistência aos macrólidos e para outros estudos epidemiológicos. Ao longo desta dissertação, o estudo epidemiológico das estirpes de GAS resistentes aos macrólidos está dividida em 3 períodos - 1998 a 2003, 2004 a 2006 e 2007 a 2011. Em todos os períodos, a taxa de resistência aos macrólidos e a prevalência de cada um dos fenótipos e genótipos de resistência foram determinadas; a caracterização molecular da população resistente envolveu técnicas como a tipagem T, a tipagem emm, “pulsed field gel electrophoresis” (PFGE) e “multilocus sequence typing” (MLST). No primeiro período, a resistência aos macrólidos foi elevada (27%), mas estável. No entanto, esta estabilidade não foi acompanhada por uma prevalência constante dos fenótipos de resistência. Em apenas 6 anos, assistiu-se a uma completa inversão na prevalência dos fenótipos de resistência. A caracterização molecular das 325 estirpes revelou uma população diversa e as linhagens genéticas identificadas em Portugal foram também identificadas noutros países Europeus; as mais comuns eram definidas por T12-emm22-ST46, T28-emm28-ST52, T4-emm4-ST39, T12-emm12-ST36 e T1-emm1-ST28. Esta situação, muito pouco usual, motivou a continuação dos estudos de vigilância epidemiológica e os resultados da análise das estirpes isoladas entre 2004 e 2006 permitiram a detecção de uma tendência decrescente na resistência aos macrólidos, que começara em 1999. Era ainda evidente uma diversidade na composição clonal da população que incluía 156 estirpes, e, com pequenas excepções, foram identificadas as mesmas linhagens genéticas, com algumas diferenças na sua prevalência. Entre as linhagens mais frequentes estavam as definidas por T28-emm28-ST52, T4-emm4-ST39, T11-emm11-ST403 e T12-emm22-ST46. Para saber se esta tendência decrescente ainda se mantinha, a resistência aos macrólidos entre 2007 e 2011 foi determinada e a composição clonal da população foi estudada (n=139). Os resultados mostraram que a tendência decrescente da resistência aos macrólidos ainda se mantinha, atingindo-se em 2011 o valor mais baixo registado em Portugal (2%), e mais uma vez, as linhagens genéticas tinham sido já descritas em Portugal e noutros países, com algumas diferenças na sua prevalência. A linhagem genética definida por T11-emm11-ST403 era agora a mais prevalente, seguida por T12-emm22-ST46 e T28-emm28-ST52. Uma das observações foi o facto de esta situação ter sido acompanhada por um elevado consumo de macrólidos, conferindo assim ênfase às flutuações dos clones na prevalência da resistência a este antibiótico. O grupo relativamente restrito de linhagens genéticas com resistência aos macrólidos está bem disseminado, mas pouco se sabe acerca dos motivos para o seu sucesso ou da sua origem - aquisição de genes de resistência seguida de expansão local, ou simplesmente disseminação geográfica. Para tentar perceber se a população de GAS estava a reflectir a população geral de S. pyogenes isolados na faringe, uma colecção de 803 estirpes, representando 50% do total de estirpes isoladas em doentes com faringo-amigdalite em Portugal, entre 2000 e 2005, foi analisada por todos os métodos de tipagem acima mencionados. Esta comparação permitiu a identificação de tipos emm específicos e clones de PFGE associados com cada um dos fenótipos de resistência aos macrólidos. Entre os tipos emm encontrados nesta colecção, os tipos emm4, emm22 e emm28 foram associados com a resistência aos macrólidos, enquanto os tipos emm3, emm6, emm87 e emm89 foram associados com a susceptibilidade a este antibiótico. A utilidade do PFGE na tipagem de GAS foi reforçada neste trabalho pois esta foi a única técnica de tipagem capaz de diferenciar estirpes resistentes e susceptíveis dentro do mesmo tipo emm. Foram exemplos disso grupos de estirpes dos tipos emm1 e emm4. Adicionalmente, ambas as populações mostraram diferenças na diversidade, indicando que a população de GAS resistentes aos macrólidos tem uma dinâmica própria, independente dos padrões de variação da população geral. Durante muito tempo, a produção das exotoxinas SpeA e SpeC foi associada ao desenvolvimento de escarlatina, uma das apresentações das infecções causadas por S. pyogenes. No entanto, a literatura é contraditória e alguns estudos não detectaram esta associação. Para tentar encontrar potenciais marcadores desta infecção, caracterizámos uma colecção de 101 estirpes associadas a escarlatina e comparámos com 202 estirpes associadas a faringite (sem o diagnóstico de escarlatina). Para isto, foi determinado o perfil de superantigénios, para além de todos os métodos de tipagem já mencionados. Os resultados mostraram que os genes ssa, speA e speC estavam associados a escarlatina, mas foi também demonstrado que as estirpes associadas a escarlatina eram menos diversas que as estirpes associadas a faringite, o que sugere que existam linhagens de maior propensão para causar esta apresentação.Fundação Calouste Gulbenkia
