Utvikling og validering av analysemetode for screening av kalsiumantagonister i fullblod/obduksjonsblod med LC-MS

Abstract

SAMMENDRAG En liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) screening metode for bestemmelse av kalsiumantagonistene amlodipin, felodipin og isradipin i fullblod/obduksjonsblod ble utviklet. Diazepam-d5 ble brukt som intern standard. Til prøveopparbeidelsen ble det utført felling av fullblod med acetonitril og metanol, videre ble det benyttet automatisert fast-fase ekstraksjon (SPE) med omvendt fase og kationbytter (mixed mode, Oasis® MCX 1cc, 30 mg) stasjonærfase. SPE-prosedyren var en modifisering av en tidligere utviklet SPE-metode for amlodipin og 13 andre hjertemedisiner. Eksperimentell forsøksdesign ble benyttet for å optimalisere prøveopparbeidelsen ved å studere variablene i et 23 faktorforsøk. Dette faktorforsøket ble satt opp på grunnlag av et preliminært faktorforsøk (24). Til HPLC-separasjonen ble det benyttet et omvendt fase separasjonssystem med C18 kolonne (Atlantis dC18, 2,1 x 150 mm) og mobilfase bestående av 10 mM ammoniumformatbuffer pH 3,1 (A) og acetonitril (B) (v/v). Det ble brukt en lineær gradient fra 90:10 A:B til 10:90 A:B på 10 minutter. Amlodipin, felodipin og isradipin ble detektert med selected ion monitoring (SIM) på MS. Analysemetoden ble validert og viste tilfredsstillende resultater. Metoden ga et ekstraksjonsutbytte på 70 ± 1,5 % for amlodipin, 83 ± 5 % for felodipin og 84 ± 4 % for isradipin. Lineariteten/kurvetilpasningen var god for amlodipin, felodipin og isradipin i hele det undersøkte område med en korrelasjonskoeffisient bedre enn 0,997 for alle stoffene. Presisjonen var god og viste et relativt standardavvik mellom 2,4-14 % for intradag variasjon og 5,4-23 % for interdag variasjon for alle stoffene. Nøyaktigheten var tilfredsstillende for alle stoffene, med et intradag avvik på 19 % eller mindre og interdag avvik mindre enn 15 %. Minste detekterbare konsentrasjon (MDK) og minste kvantifiserbare konsentrasjon (MKK) ble beregnet på to måter. Den ene beregningsmåten ga minste detekterbare konsentrasjon (MDK) 0,07 µmol/l, 0,5 µmol/l og 0,03 µmol/l for henholdsvis amlodipin, felodipin og isradipin, og minste kvantifiserbare konsentrasjon (MKK) ble 0,2 µmol/l, 0,7 µmol/l og 0,08 µmol/l for henholdsvis amlodipin, felodipin og isradipin. Den andre beregningen ga MDK 0,02 µmol/l, 0,5 µmol/l og 0,03 µmol/l for henholdsvis amlodipin, felodipin og isradipin, mens MKK ble 0,04 µmol/l, 0,5 µmol/l og 0,08 µmol/l for henholdsvis amlodipin, felodipin og isradipin. Resultat fra et robusthetsfaktorforsøk (25-1) for prøveopparbeidelse og SPE-ekstraksjonen viste ikke statistisk signifikante funn, og metoden ble bestemt til å være tilfredsstillende robust. Analysemetoden viste seg å være spesifikk for amlodipin, felodipin og isradipin basert på at en rekke (n=80) andre medikamenter/stoffer ble analysert på metoden uten å gi noen falske positive resultater. Ioneundertrykking/ioneforsterkning fra andre stoffer og fra matriks ble undersøkt, men ikke observert å være et problem