Messung von L-Asparaginase-Antikörper-Titern von pädiatrischen Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie der Nordic Society of Pediatric Hematology and Oncology unter Einsatz eines epitopspezifischen ELISA

Abstract

L-Asparaginase wird seit mehr als etwa 30 Jahren in der Behandlung der akuten lymphatischen Leukämie sowie einiger Non-Hodgkin-Lymphome im Kindes- und Erwachsenenalter eingesetzt. Die zytotoxische Wirksamkeit des Enzyms beruht auf der Depletion der L-Asparagin-Serumkonzentration durch Hydrolyse der Aminosäure L-Asparagin in L-Asparagin¬säure und Ammoniak. Durch die fehlende Möglichkeit der Tumorzellen ausreichend L-Asparagin zu synthetisieren, kommt es zu einer Beeinträchtigung des Tumorzellstoff-wechsels und schließlich zum Zelluntergang. Aufgrund der bakteriellen Herkunft sind immunologische Reaktionen häufige Neben-wirkungen einer Therapie mit L-Asparaginase. Die Formation von spezifischen Anti-körpern nach Sensibilisierung durch das Protein manifestiert sich klinisch in unter-schiedlicher Ausprägung. Bis zu 30% der Patienten erleiden eine Hypersensitivitäts-reaktion, welche von lokalen Reizerscheinungen bis hin zu einer systemischen Anaphylaxie reicht. Daneben kann es bei einigen Patienten zu einem schnellen Abfall der Enzymaktivität kommen. Infolge der fehlenden klinischen Symptomatik nennt man diesen Vorgang auch „stille Inaktivierung“. Dieses Phänomen übt entscheidenden Ein-fluss auf die Pharmakokinetik des Enzyms und schließlich auf den gesamten Therapie-erfolg aus. Eine Messmethode zur Bestimmung von Antikörpern gegen L-Asparaginase ist bis heute aufgrund der mangelnden Sensitivität und Spezifität in der klinischen Routine nicht eingeführt. Der Einsatz des Gesamtproteins als Antigen in den gegenwärtigen Assays führt zu Kreuzreaktionen, welche eine Aussage über zu erwartende immunologische Reaktionen erheblich einschränken. Drug-Monitoring Pro¬gramme nutzen daher zur Therapiekontrolle die Messung der Enzymaktivität. Zur Verbesserung der Vorhersagegenauigkeit einer klinisch relevanten immunolo-gischen Reaktion wurden Forschungsarbeiten mit dem Ziel der Entwicklung einer epitopspezifischen Messmethode von Antikörpern gegen L-Asparaginase gestartet. Für dieses Projekt wurden in der vorliegenden Arbeit anstatt des Gesamtproteins sechs synthetisch hergestellte Fragmente der L-Asparaginase als Antigene in einem ELISA eingesetzt. Es erfolgte ein Screening auf Antikörper-Bindung unter Verwendung der Seren von 42 pädiatrischen Patienten mit und ohne einer „stillen Inaktivierung“ aus der NOPHO-ALL 2000 Studie, einer multizentrischen ALL-Therapiestudie für Kinder und Jugendliche in den skandinavischen Ländern. Es konnte ein Zusammenhang zwischen der Bindung von Antikörpern an zwei der sechs Peptide und einer „stillen Inaktivierung“ beobachtet werden. Im untersuchten Kollektiv lag für Patienten mit einer raschen Inaktivierung der Enzymaktivität (n=19) am Ende der Reinduktion eine signifikant häufigere Bindung von Antikörpern an das Fragment mit den Aminosäuresequenzen (AS) 1-136 als in der Kontrollgruppe (n=14) vor. Eine häufige, nicht signifikante Bindung konnte an das Fragment mit den AS 214-326 nachgewiesen werden. Ein signifikant höherer Anstieg der Antikörpertiter von der Induktion zur Reinduktion zeigte sich in der Gruppe der „stillen Inaktivierer“ versus der „therapeutischen Aktivität“ für das Fragment mit den AS 1-136 sowie für das L-Asparaginase-Gesamtprotein. Die Sequenzen 1-136 und 214-326 entsprechen dem N- bzw. C-terminalen Anteil des L-Asparaginase-Moleküls und liegen im Bereich des aktiven Zentrums des Enzyms. Eine Bindung von Antikörpern an hier lokalisierten Epitopen führt möglicherweise zu einer Beeinflussung der enzymatischen Aktivität und liefert vermutlich eine Erklärung für den Vorgang der „stillen Inaktivierung“. Patienten mit Enzymaktivität im therapeutischen Bereich (n=23) wiesen nur eine geringe Antikörperbindung auf. Kreuzreaktionen beeinträchtigten auch die Mess-methode des epitopspezifischen Assays. Der Einfluss von Kreuzreaktionen bei der Messung von Antikörpertitern gegen das L-Asparaginase-Gesamtprotein war entgegen der Erfahrung publizierter Arbeiten nur gering. Durch weitere prospektive Studien könnte eine Optimierung des epitopspezifischen Antikörper-Assays und der damit verbundenen Identifikation klinisch relevanter Epitope erreicht werden. Für eine Therapie mit L-Asparaginase bleibt innerhalb eines rationalen Drug-Monitorings die Messung der Enzymaktivität zunächst unersetzlich