Atividade antitumoral das associações de vitamina C com vitamina K3, microencaspuladas ou com ortovanadato de sódio

Abstract

tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013Introdução: A vitamina C (VC) e vitamina K3 (VK3) têm atividade citotóxica, antiproliferativa e antitumoral. A citotoxicidade da VK3 é potencializada quando associada com VC. O encapsulamento com quitosana pode retardar ou controlar a liberação de VCK3 prevenindo contra reações de biotransformação prematuras e aumentar a estabilidade e biodisponibilidade. Relatos na literatura mostram que compostos de vanádio induzem o estresse oxidativo in vitro sugerindo este como um possível mecanismo de ação para seu efeito antineoplásico. Adicionalmente, alguns autores têm evidenciado que VC possui atividade antioxidante, mas também possui efeito citotóxico sobre células malignas através de atividade pró-oxidante em elevadas doses. Objetivo: nesse trabalho pretendeu-se avaliar a atividade citotóxica, pró-apoptótica e antitumoral da associação das VC e VK3 microencapsuladas com quitosana e a potencialização do efeito antitumoral do ortovanadato de sódio pela associação com VC. Metodologia: A liberação da VC das micropartículas de VC e VCK3 foi avaliada por CLAE. A citotoxicidade das micropartículas de VC, VK3 e VCK3 foi avaliada em células de câncer de mama (MCF7) e a citotoxicidade de ortovanadato e associação de ortovanadato e VC em células de câncer de bexiga (T24). O efeito antitumoral foi avaliado em líquido ascítico de camundongos isogênicos Balb/c inoculados com células de tumor de Ehrlich. Resultados: A liberação da VC das micropartículas de VC e VCK3 mostrou ser sustentada por mais de seis horas. O tratamento com VK3 encapsulada (E) foi o mais citotóxico (CI50 = 18,15 M) quando comparado com VC (CI50 > 9,65 mM) e VCK3 (CI50 = 9,17 mM:51,58 M) os quais não tiveram as respectivas citotoxicidades aumentadas após microencapsulamento. Na avaliação do efeito antitumoral in vivo os tratamentos com VCK3 (E) e VK3 (E) resultaram na maior redução da variação do peso do corpo (66,98 e 56,92 %). VCK3 (E) resultou na maior inibição do crescimento tumoral (66,20 %), seguido de VK3 (NE) (49,86 %). VCK3 (E) resultou em maior aumento de tempo médio de sobrevida (TMS = 16,5 dias) e percentual de longevidade (PAL = 42,30 %) sugerindo assim as micropartículas com efeitos antitumorais mais promissores. O dano oxidativo em proteínas (0,068 mol/mg) foi maior após o tratamento com VCK3 (E) o que pode ser resultado de estresse oxidativo. Os tratamentos com VC (NE), VC (E), VCK3 (NE) causaram os maiores aumentos nos níveis de peroxidação lipídica (9,0; 7,5; 7,0 nmol/g, respectivamente). A apoptose foi determinada nas células ascíticas de tumor de Ehrlich especialmente após VCK3 (E) e VK3 (NE) observando-se 38 e 52 % de células apoptóticas. Na avaliação da potencialização do efeito antitumoral de ortovanadato de sódio (Na3VO4) e associação com VC a citotoxicidade, inibição da proliferação celular, geração de ERO e fragmentação de DNA foram feitas com a linhagem de células de câncer de bexiga (T24). Ortovanadato de sódio (0,5-10 M) foi citotóxico contra a linhagem tumoral (CI50 = 5,8 M), mas a associação com VC (100 ?M) apresentou maior citotoxicidade (CI50 = 3,3 M). A associação ortovanadato e VC aumentou a inibição da proliferação celular (mais de 20 %) dependente da concentração e a geração de ERO (quatro vezes) indicando que esse pode ser um mecanismo de ação da associação ortovanadato e VC. Não foi significativa a clivagem do DNA plasmidial, sendo assim, não houve sinergismo da associação ortovanadato/VC, pois o efeito da associação não foi maior que a ação do ortovanadato e VC individualmente. A avaliação da atividade antitumoral sobre células de carcinoma ascítico de Ehrlich inoculadas em camundongos Balb/c mostrou que os tratamentos com ortovanadato (18,75 mg/kg/dia) e associação ortovanadato/VC (18,75:187,50 mg/kg/dia) reduziram as medidas de variação de peso do corpo, variação da circunferência abdominal e volume de líquido ascítico quando comparados aos grupos de controle (com tumor e sem tratamento). Houve inibição do crescimento do tumor (73,71 %) quando comparado ao tratamento realizado somente com ortovanadato de sódio (45,07 %) e aumento da longevidade (TMS = 55,56 %). As células de tumor de Ehrlich retiradas dos camundongos foram usadas para determinar a atividade de enzimas antioxidantes, o dano oxidativo e o tipo de morte celular. Nessas células os tratamentos com ortovanadato sozinho e em associação com VC aumentaram a atividade da catalase, mas somente a associação ortovanadato e VC aumentou a atividade de SOD (mais de quatro vezes). O dano oxidativo em proteínas e lipídios foi maior devido ao tratamento feito com associação ortovanadato/VC (2-3 vezes). A morte celular após o tratamento com associação ortovanadato e VC ocorreu por apoptose (41,18 %) e foi devido à inibição de Bcl-xL e ativação de Bax. Conclusão: com isso sugere-se que a associação VC e VK3 microencapsuladas com quitosana e associação ortovanadato/VC apresentaram efeitos citotóxico, pró-apoptótico e antitumoral nas linhagens celulares testadas e nos ensaios in vivo e possivelmente o aumento da geração de espécies reativas de oxigênio seriam um dos mecanismos de ação associado a estes efeitos observados.Abstract: Introduction: There are at least three decades, efforts have been directed towards developing drugs as or more effective than traditional chemotherapy, but less toxic and less likely to induce multidrug resistance. Vitamin C (VC) and vitamin K3 (VK3) have cytotoxic, antiproliferative and antitumor activities. The cytotoxicity of VK3 is enhanced when combined with VC. It has also been shown that vanadium compounds induce oxidative stress and lipid peroxidation in vitro and there are some reports indicating the possible anticancer effect of vanadium on tumor cells. Additionally, some authors have shown that VC has antioxidant activity, but also possesses cytotoxic effect in elevated doses on malignant cells through pro-oxidant activity. Objective: In this study, we evaluated the cytotoxic, pro-apoptotic and anti-tumor involvement of the VC and VK3 microencapsulated with chitosan. It was also investigated the potentiation of antitumor effect of sodium orthovanadate by the association with VC. Methodology: The VC release from the microparticles was analyzed by HPLC when it was proved that the release is sustained for more than six hours. The evaluation of cytotoxicity of microparticles VC and VK3 was performed on MCF7 cells. Results: Treatment with encapsulated VK3 (E) was the most cytotoxic (IC50 = 18.15 µM), whereas the treatments evaluated with VC (IC50 > 9.65 mM) and VCK3 (IC50 = 9.17 mM: 51.58 µM) had increased their cytotoxicities after microencapsulation. In evaluating the antitumor effect on cells of Ehrlich ascites tumor in Balb-c mice, it was found an antitumor effect after all treatments with the microparticles. VCK3 (E) and VK3 (E) resulted in greater reduction of the body weight variation (66.98 and 56.92 %). VCK3 (E) also resulted in the greatest inhibition of tumor growth (66.20 %), followed by VK3 (NE) (49.86 %). VCK3 (E) resulted in an increase of median survival time (MST = 16.5 days) and a higher percentage increase in lifespan (PAL = 42.30 %). Thus the microparticles with the combination VCK3 (E) have promising antitumor effects. Oxidative damage of proteins (0.068 µmol/ mg) was higher after treatment with VCK3 (E) comparing with negative control (0.007 µmol / mg) which may result from oxidative stress. The treatments with VC (NE), VC (E), and VCK3 (NE) caused the greatest increases in the levels of lipid peroxidation (9.0; 7.5; 7.0 nmol/g). Apoptosis was determined in cells of ascitic Ehrlich tumor after VCK3 especially (E) and VK3 (NE) with 38 and 52 % of apoptotic cells. In evaluating the antitumor effect of sodium orthovanadate (Na3VO4) it was found that the potentiation of the toxicity was associated with the combination with VC. Cytotoxicity, inhibition of cell proliferation, generation of ROS and DNA fragmentation were evaluated using T24 cells. Sodium orthovanadate (0.5-10 µM) was cytotoxic against tumor cells T24 (IC50 = 5.8 µM) whereas the association with VC (100 µM) showed IC50 = 3.3 µM. The association orthovanadate/VC caused increased concentration dependent inhibition of cell proliferation (over 20 %) and increased generation of ROS (four fold) indicating that this may be one mechanism of action of the association orthovanadate/VC in T24 cells. There was no cleavage of plasmid DNA, so there was no synergism for the association orthovanadate/VC, because the effect of the combination was not higher than the action of orthovanadate and VC individually. Antitumor activity was evaluated on cells of Ehrlich ascites carcinoma inoculated into Balb/c mice. Treatment with orthovanadate (18.75 mg/kg/day) and association orthovanadate/VC (18.75:187.50 mg/kg/day) reduced significantly the measures of variation of body weight, waist circumference variation and volume of ascites fluid compared to animals in the negative control group (tumor without treatment). There was inhibition of tumor growth (73.71 %) compared to treatment carried out only with sodium orthovanadate (45.07 %) also increased the longevity of animals (MST = 55.56 %). Cells taken from mice with tumor Ehrlich ascites were used to determine the activity of antioxidant enzymes, oxidative damage and type of cell death. In these cells orthovanadate alone and in combination with VC increased catalase activity, but only the association orthovanadate / VC increased the activity of SOD (more than 4 fold). Oxidative damage to proteins and lipids were higher due to the association with treatment done orthovanadate / VC (2-3 times). It was demonstrated that cell death after treatment with combination orthovanadate / VC occurred by apoptosis (41.18 %) related to the inhibition of Bcl-xL and Bax activation. Conclusion: from these results it can be suggested that the association with VC and VK3 microencapsulated chitosan and association orthovanadate / VC showed cytotoxic, pro-apoptotic and anti-tumor activities related to increased generation of reactive oxygen species in cell lines tested and in vivo assays