Inventarisatie analysemethodes vitamine B1 en B2. De extraktie van vitamine B1 en B2 dient voor een aantal levensmiddelen nader onderzocht te worden. Het is zinvol een automatische methode voor vitamine B1 en B2 op te starten. HPLC methodes zijn voor de levensmiddelenanalyse nog in een beginstadium

Hollman, P.

Oostenbrink, T.

Name not available

Literatuuroverzicht analysemethodes voor vitamine B1 en B2

Wageningen Yield 

Afd. Veevoeders en Meststoffen 
VERSLAG 82.21 
1982-03 -09 
Pr.nr. 505.0100 
Onderwerp : Literatuuroverzicht analyse-
methodes voor vitamine n1 
en n2 
Verzendlijst: direkteur, sektorhoofd (3x), direktie VKA, afd. 
8221 
Veevoeders en Meststoffen (4x), afd. Normalisatie 
(Humme), Projektbeheer, Projektleider (Hollman). 
Afdeling Veevoeders en Meststoffen 1982-03 -09 
VERSLAG 82.21 Pr.nr . 505 .0100 
Project: Ont1-1ikkeling methodes voor het bepalen van nutriënten in 
levensmiddelen 
Onder1-1erp: Literatuuroverzicht analysemethodes voor vitamine B1 en B2 
Doel: 
Inventarisatie analysemethodes vitamine B1 en B2• 
Samenvatting en conclusie: 
De extraktie van vit. B1 en B2 dient voor een aantal levensmiddelen 
nader onderzocht te 1-1orden. 
Het is zinvol een automatische methode voor vit. B1 en B2 op te star-
ten. HPLC methodes zijn voor de levensmiddelenanalyse nog in een 
beginstadium. 
Ve rantto1oordelijk: ir P . Hallman t:t\ 
Medewerke rs/samenstellers: T. Oostenbrink/ir P. Hallman 
® Projectleider: ir P. Hallman 
8221.0 
1 VITAHINE Bl 
1.1 Inleiding 
Vitamine B1 of thiamine behoort tot de groep der \"a teroplosbare vita-
mines en heeft de volgende struktuurfo rmule: 
In natuurlijk materiaal komt B1 voor een gering deel als "vrij" 
thiamine, dat wil zeggen als thiaminezout voor. Het belangrijkste deel 
is echter gebonden aan andere verbindingen: thiamine-ortho en 
-pyrofosforzure esters , thiamine disulfide en fosforzure esters hier-
van, thiamine - eiwitverbindingen. 
Thiamine in de vorm van thiaminehydrachloride lost zeer goed op in 
water . In zuur milieu (pH 2-3) is thiamine relatief stabiel, zelfs bij 
sterk verhitten en onder inwerking van zuurstof. In alkalisch milieu 
is het echter onstabiel , vooral bij temperaturen boven 100°C. 
1.2 HETHODES 
1.2.1 Fluorimetrische thiochroommethode 
Dit is de meest toegepast methode die berust op de fluorimetrische 
bepaling van thiochroom dat in alkalisch milieu door oxidatie van 
thiamine gevormd 1"ordt (1,2,3,4). Noodzakelijk voor deze bepaling is 
dat het vit. B1 vrijgemaakt 1"ordt uit zij n verbindingen. Een univer-
seel schema hiervoor is: a) zure hydrolyse b) behandeling met pro -
teolytische enzymen c) eventueel reduktie met cysteine om thiamine uit 
disulfiden vrij te maken d) behandeling met fosfatasen. Onderzocht 
werd de meest geschikte extraktietechniek voor een groot aantal 
levensmiddelen (9). 
Het aldus vrijgemaakte thiamine wordt in alkalisch milieu geoxideerd 
met behulp van K3Fe(CN)6• Bij de meting van het ontstane thiochroom 
moet echter rekening gehouden worden met matrixeffekten: quenching, 
storing van fluorescerende stoffen anders dan thiochroom. 
8221.1 - 2 -
- 2 -
Traditioneel probeert men deze storingen te verwijderen door v66r de 
oxidatiestap een kolomzuivering toe te passen met behulp van een 
kationwisselaar (Decalso, Permutit T) (1,4). De resterende aspecifieke 
fluorescentie 1~ordt bepaald door in het monster een blanko bepaling 
uit te voeren zonder oxidatie. Kritiek op deze handelswijze komt van 
(15) die aantoont dat de quenching nog niet opgeheven is en (16) die 
bewijst dat op de bovenvermelde wijze inaccurate blanko's verkregen 
~~orden , omdat storende bestanddelen door K3Fe(CN) 6 geoxideerd worden 
en aspecifieke fluorescentie veroorzaken. Gewezen wordt door (17) op 
het feit dat de recovery van B1 van de Decalsokolom onvolledig en 
variabel is. Verbetering van de blancobepaling is mogelijk als de 
blankewaarde bepaald 1~ordt in aam1ezigheid van K3Fe(CN) 6 en reagentia 
die de vorming van thiochroom verhinderen. Hiervoor gebruikt (5) 
bisulfiet, (20) benzeensulfonylchloride (BSC) en (18) destruktie van 
thiamine door thiaminase of UV licht (9). Alternatieven voor de 
Decalsokolom worden gegeven door (10,18) waarbij het extrakt van de 
enzymatische hydrolyse gezuiverd wordt door te wassen met isobutanol 
(4,16) en waarbij de blanko bepaalcl wordt met BSC of bisulfiet en 
gecorrigeerd wordt voor quenching m.b.v. een interne B1 standaard. 
1.2.2 Automatische methodes 
Deze zijn gebaseerd op de thiochroommethode en hebben als bijkomend 
voordeel dat de reaktiekondities konstant zijn l'laardoor de variatie-
coefficient van de bepaling gereduceerd l'lordt. 
1.2.2.1 Methode zonder Decalsozuivering, blankebepaling door weglaten 
van de oxidatiestap met K3Fe(CN) 6 meting t.o.v. externe standaard (8, 
10, 18) deze laatste geeft een kombinatie van de B1 en de n2 bepaling. 
Zuivering geschiedt door het extrakt na enzymatische hydrolyse te 
wassen met isobutanol, een stap die alleen bij (10) geautomatiseerd 
is. De methode werd toegepast op melkprodukten, groente en fruit en 
graanprodukten en vergeleken met de AOAC handmethode (4). De voorge -
stelde methode gaf betere resultaten, zowel kwa recovery als 
standaardafwijking . 
8221.2 
- 3 -
- 3 -
1.2.2.2 Methode met Decalsokolom, blanko's door bestraling met 
UV-licht, meting t.o.v. externe standaard, n1 en B2 ge kombineerd 
(9,19). Onderzocht werden een twintigtal produkten, nl. vlees-, 
visprodukten, melk - zuivelprodukten , deegt~aren, groente en fruit. De 
extraktieprocedure werd hierbij nader onderzocht. 
1.2.2.3 Methode zonder Decalsokolom, blanko meting met BSC en interne 
n1 standaard (16). Een vergelijking wordt gemaakt met de AOAC hand-
methode (4) en methode 1.2.2.1, waarbij graanprodukten, deegwaren, 
leverpastei en tomatenpuree geanalyseerd werden. De BSC - methode 
voldeed duidelijk het beste. 
1.2.3 Polarografie 
Polaragrafische methodes zijn geschikt voor de kontrole van far -
maceutische preparaten en bij levensmiddelen alleen toepasbaar indien 
verschillende zuiveringsstappen uitgevoerd 1o10rden (2). Kombinatie van 
papierchromatografie en polarografie is mogelijk (1). 
1.2.4 Geinduceerde natrium azide jodium reaktie 
Hierbij wordt thiamine geisoleerd op een Decalso of Amberlite IRC 50 
kolom. Het verbruik van 12 in deze reactie is evenredig aan de 
hoeveelheid thiamine. De naUI~keurigheid en gevoeligheid van de methode 
komen overeen met die van de thiochroommethode; maar de me thode is 
sneller en simpeler. De methode werd toegepas t op vleesprodukten, 
(12), de recovery bedroeg 93-99%. 
1.2.5 GLC 
5-(2-hydroxyethyl)-4 -methylthiazol ontstaat bij inwerking van sulfiet 
op thiamine. Deze omzetting is kt~antitatief ( 7). Het thiazol kan 
gaschromatografisch (gepakte kolom, stationaire fase Triton 
X -305/Ionex 330, FID) be paald twrden. De methode t~erd ontwikkeld voor 
zgn. "Pintobonen". Vergelijking met de thiochroommethode leverde 
variabele resultaten . 
1. 2. 6 HPLC 
1.2.6.1 Voor vit . n1 en n2 in rijs tprodukten wordt een HPLC methode 
beschreven: scheiding op een RP Cl8 kolom, elutie me t ionpa iring, 
detektie in UV -gebied (22). 
8221.3 
- 4 -
- 4 -
1.2.6.2 Voor graanprodokten wordt een vergelijkbare methode als 
1.2.6.1 beschreven (24). Vergelijking met een automatische thiochroom-
methode leverde geen signifikante verschillen. 
1.2.6.3 Bepaling van vit. B1 en B2 in bloemkool, aardappelprodokten en 
vlees. Thiamine twrd t op de gebruikelijke manier geëxtraheerd (AOAC) 
en m.b.v . K3Fe(CN)6 omgezet in thiochroom dat na extraktie met isohu-
tanol geinjekteerd tvordt op een RP C8 10 J.llll kolom. Elutie geschiedt 
!sokratisch met methanol/acetonitril/isobutanol (80/10/10), detektie 
via fluorescentie (23). Recovery ' s van 94-105% werden bereikt . 
1.2.6.4 Bepaling van vit. B1 en B2 in vleesprodukten. Na extraktie en 
omzetting in thiochroom (AOAC) wordt het isobutanolextrakt geinjek-
teerd op een silica spherisorb 20 J.Jm kolom en isokratisch geelueerd 
met chloroform/methanol (90:10), detektie via fluorescentie (14). 
Recovery van 83-102% worden gerapporteerd. Methode 1.2.6.1 werd ook 
toegepast op de onderzochte produkten, echter zonder succes omdat de 
UV detektor niet gevoelig genoeg bleek. Bovendien was de scheiding 
niet volledig. 
1.2.7 Mikrobiologische methoden 
Lactobacillus ferment!, Lactobacillus viridescens, Ochromonas danica 
en Kloeckera brevis worden toegepast bij de mikrobiologische bepaling 
van thiamine (1,18,3). Een probleem vormt het feit dat de mikroorga-
nismen vaak op dezelfde wijze reageren op de afbraakprodokten van 
thiamine als op het thiamine zelf (3). Ochromonas en Kloeckera werken 
specifieker dan de Lactobacilli, maar de bepaling met deze mikroorga-
nismen is bewerkelijker. Van de Lactobacilli is Lactobacillus viri-
descens het meest specifiek. Gerapporteerd wordt door (18) een 
vergelijkend onderzoek met de AOAC-handruethode, de AutoAnalyser 
methode 1.2.2.1 en de mikrobiologische methode met Lactobacillus viri-
descens, waarbij de mikrobiologische methode de beste resultaten gaf . 
1.2.8 Diverse methoden 
Minder specifieke methoden waarvoor hogere detektiegrenzen gelden en 
die gedeeltelijk eenvoudiger en nauwkeuriger zijn worden door (1) 
beschreven. Ze zijn alleen geschikt voor de bepaling van thiamine in 
farmaceutische preparaten. 
8221.4 
- 5 -
- 5 -
2 VITAtUNE B2 
2.1 Inleiding 
Vitamine B2 of riboflavine wordt gerekend tot de groep der wateroplos-
bare vitamines en twrdt gekarakteriseerd door de volgende struktuur-
formule: 
Het komt in natuurlijk materiaal bijna alleen in gebonden vorm voor: 
als fosforzure ester (flavinemononukleotide FHN), als flavineadenine-
dinukleotide (FAD) en gebonden aan eiwitten. Riboflavine lost slecht 
in tolater op, de oplosbaarheid tolordt verhoogd in ztolak zuur en zwak alka-
l isch milieu. Onder invloed van licht wordt riboflavine zeer snel 
afgebroken , tolaarbij verhoging temperatuur het afbraakproces versnelt. 
In alkalisch milieu is het vitamine eveneens toleinig stabiel. Verhitten 
en lucht zuurstof alleen he bbe n over het algemeen geen invloed. 
2.2 Nethocles 
2.2.1 Fluorimetrische methode 
Dit is de meest toegepaste chemische methode. Het riboflavine tolordt 
warm geextraheerd in zuur milieu evt . m.b.v. een autoklaaf (2,3,4). 
Bij deze behandeling worden FAD en FHN volledig gehydroliseerd . 
Storingen (eiwitten) worden verwijderd door de pH te verhogen tot 6 , 5 
en daarna met verdund zuur toleer te verlagen tot+ 4,5 (4), of door 
e nzymatisch e hydrolyse met diastase of clarase tolaarbij hogere resul ta-
ten verkregen twrden, waarschijnlijk omdat adsorptief aan eiwitten 
gebonden fosforzure riboflavine -es ters vrijge maakt 1o~orden (2, 9) . 
8221.5 
- 6 -
- 6 -
Bij fruit blijkt het soms noodzakelijk ethyleenglycolmonomethylether 
toe te voegen om te voorkomen dat riboflavine of thiamine geadsorbeerd 
1o10rden aan onoplosbaar materiaal (9). Meting van de fluorescentie van 
het vrije riboflavine geschiedt bij pH 3-5, omdat alleen in dit gebied 
de fluorescentie onafhankelijk is van de pH. Rekening gehouden moet 
worden met aspecifieke fluorescentie. Algemeen 1vordt een clean-up door 
oxidatie met KMn04 toegepast. (2) Wijst erop dat door deze oxidatie 
ook nieu1ve aspecifieke fluorescentie kan ontstaan. Een extra 
zuiveringsstap door kolomchromatografie met een kationwisselaar 
(Permutit T) v66r de oxidatie met KMno4 wordt door (1) beschreven. De 
restfluorescentie lvordt bepaald na red uktie van riboflavine met 
Na 2s2o4 (dithioniet). Door (2) wordt opgemerkt dat aangezien 
Na 2s2o4 een sterk reduktiemiddel is fouten kunnen ontstaan als ook 
aspecifieke fluorescentie vernietigd 1o10rd t door Na 2s 2o4 • Steeds tvord t 
na de extraktie een interne standaard n2 toegevoegd. 
2.2.2 Automatische methodes 
Deze zijn gebaseerd op de fluorimetrische methode. 
2.2.2.1 Methode voor B1 en B2 (zie methode 1.2.2.2). De extraktie van 
B1 en B2 geschiedt met één procedure. n2 1vordt geextraheerd met 
pyridine -butanol , blanko 1 s tvorden bepaald door n2 af te breken m.b.v. 
UV-licht . De methode tverd vergeleken met methode 2. 2. 2.3 waarbij 
graanprodokten melkpoeder, brood , macaroni en meel geanalyseerd wer-
den met beide methodes. De resultaten waren onderling goed 
vergelijkbaar. 
2.2.2.2 Methode voor n1 en B2 een extraktieprocedure voor n1 en B2 nl. 
enzymatische hydrolyse, geen dialyse, reduktie van overmaat KMno 4 
geschiedt met hydroxylaminehydrochloride geen interne standaardmethode 
(10, 13). Tien verschillende soorten babyvoeding t'lerden onderzocht en 
vergeleken met de AOAC handmethode (4). De variatiecoefficient van de 
geautomatiserde methode 1vas kleiner, de recovery bedroeg 100-106%. 
2.2.2.3 Methode voor n2, extraktieprocedure via een enzymatische 
hydrolyse, verwijdering storende stoffen door dialyse gevolgd door 
oxidatie met KHno 4 (11,21). 
8221.6 
- 7 -
- 7 -
Een vergelijkend onderzoek met deze methode en de AOAC-handmethode, 
to~erd uitgevoerd door 16 labs, waarvan 6 labs de automatische methode 
uitvoerden, gaf voor de 10 onderzochte produkten het veno~achte betere 
resultaat voor de automatische methode. 
2.2.3 Lumiflavinemethode 
Deze methode is specifieker dan de fluorescentiemethode (1) . Ze berust 
op het principe dat in alkalisch milieu alleen riboflavine, in 
tegenstelling tot andere flavines, door UV-licht omgezet wordt in 
lumiflavine waarvan de fluorescentie gemeten kan worden. Het ribofla-
vine 1<10rdt warm geextraheerd in zuur milieu (6), evt. m.b.v. een 
autoklaaf (1) en vrijgemaakt door enzymatische hydrolyse met diastase 
of clarase . Zuivering geschiedt door uit schudden met chloroform. Bij 
pH 10-12 wordt riboflavine omgezet door UV-licht in lumiflavine. De 
omzetting is niet kwantitatief (60-70%), reden 1o1aarom een interne 
standaard toegevoegd wordt. Het lumiflavine 1o10rdt geextraheerd met 
chloroform en de fluorescentie gemeten . 
2.2.4 HPLC 
2.2.4 .1 Methode met UV-detektie, zie methode 1.2.6.1 en 1.2.6.2. 
2. 2.4.2 Bepaling van n2 in melkprodukten (25). De ei1o~itten worden 
neergeslagen met TCA, het 1o~aterig extrakt geinjekteerd op een 
ODS-Sil-X-1 kolom en !sokratisch geelueerd met water/acetonitril 
(92/8). Detektie d.m.v. fluorescentie , vrij n2 en een fosforzure ester 
van n2 werden gescheiden. 
2.2.4.3 Bepaling van B1 en n2 in vleesprodukten (zie methode 1. 2. 6. 4). 
Het n2 \o~ordt omgezet in lumiflavine en geextraheerd met chloroform. 
Het chloroformextrakt wordt op dezelfde wijze als bij n1 gechromato-
grafeerd. Recovery's van 82-102% werden gevonden. 
2. 2.4.4 Zie methode 1.2.6.3. Vit . B1 en B2 worden op dezelfde wijze 
geextraheerd. Het hydrolysaat wordt gezuiverd met chloroform en het 
waterig extrakt geinjekteerd op een Lichrosorb-NH2 kolom en !sokra-
tisch geelueerd met methanol/NaAc buffer pH 4,5 (50:50) , detektie via 
fluorescentie. Recovery's 97-103%. 
8221.7 
- 8 -
- 8 -
2.2.5 Polarografie 
De polaragrafische methode is vooral geschikt voor de analyse van 
vitaminepreparaten (1). Voor biologisch materiaal is deze techniek 
niet geschikt (2). 
2.2.6 Mikrobiologische methoden 
Lactobacillus helvetleus (ook wel Lactobacillus caseiL genoemd) wordt 
voor de riboflavine bepaling gebruikt (1). Zetmeel , glycogeen, vrije 
vetzuren en bepaalde eiwitten storen en moeten vooraf venolijderd 
worden. De gevoeligheid van riboflavine voor licht en een alkalisch 
milieu zijn bij de voor de mikrobiologische methode sterke verdunning 
zeer storend , zodat de reaktie onder uitsluiting van licht moet 
plaatsvinden en zelfs glasto1erk vooraf met zuur gespoeld moet worden. 
3 DISKUSSIE 
De analysemethodes voor vit. B1 en B2 (handmethodes) die op dit 
ogenblik door het RIKILT toegepast worden (5,6) zijn gezien de litera-
tuur een goede keuze. De extraktie van B1 en B2 zou voor een aantal 
levensmiddelen nader bekeken moeten t'lorden (9). De geautomatiseerde 
vit. B1 en B2 bepaling biedt een mogelijkheid tot verbetering van 
zowel de efficiency als betrouwbaarheid van de analyse. Onderzocht 
zouden moeten worden de BSC variant met interne standaard voor vit. 
B1 (16) en de methode met dialyse en KMn04 behandeling voor vit. B2 (21). 
Er is in de literatuur slechts een beperkt aantal HPLC methodes voor 
levensmiddelen beschreven. UV detektie biedt voor de gekompliceerde 
matrix van levensmiddelen geen perspektief. De beschreven methodes 
bieden nog geen verbetering t.o.v. de automatische methodes. Voor vit. 
B1 zal post-column reaktie een verbetering opleveren. 
4 KONKLUSIE 
De extraktie van vitamine B1 en B2 dient voor een aantal levensmid-
delen nader bekeken te worden. Het is zinvol een automatische methode 
voor vitamine B1 en B2 op te starten . 
HPLC methodes zijn voor de levensmiddelenanalyse nog in een beginsta-
dium. 
8221.8 
- 9 -
- 9 -
5 LITERATUUR 
1. R. Strohecker, H.M. Henning - Vitamin - Bestimmungen (1963), 
Verlag Chemie GMBH, Weinheim/Bergs tr. 
2. Schormüller - Handbuch der Lebensmittel, Analytik der 
Lebensmittel, Band II/2.Teil (1967), Springer Verlag . 
3. Methods of Vitamin Assay, The Association of Vitamin Chemists 
Inc., third ed. (1966) Interscience Publishers. 
4. AOAC, Official Methods of Analysis, (1980) 13th ed., AOAC, 
Arlington, VA, secs. 43.024-43.030, 43.039-43.043. 
5. Publikatieblad EEG, (1973) nr. L 83, 30-31. 
6. Voorstel EEG 1323/4/VI/67-D. 
7. R.M. Seifert, C.F. Hiller, J. Assoc. Off. Anal. Chem. (1973) ~, 
1273-1276. 
8. J.R. Kirk, J. Assoc. Off. Anal. Chem. (1974), 1Z, 1081-1084. 
9 0. Pelletier, R. Hadère, J. Assoc. Off. Anal. Chem. (1977), i2_, 
140-146. 
10. W.E. Dunbar, K.E. Stevenson, J. Assoc. Off. Anal. Chem. (1979), 
g, 642-64 7. 
11. D.C. Egberg, J. Assoc. Off. Anal. Chem. (1979), g, 1041 -1044. 
12. Food Sci. Techn. A. (1981) 11, 8 S 1327 . 
13. B.S. Jacobson, J. Assoc. Off. Anal. Chem. (1977), i2_, 147 -150 . 
14. C.Y.H. Ang, F.A. Hoseley, J. Agric. Food. Chem., (1980), ~, 
483-486. 
8221 .9 
- 10 -
- 10 -
15. H.N. Ridyard, Analyst, (1950), ~, 634-650. 
16. A.H. Soliman, J. Assoc. Off. Anal. Chem., (1981), ~, 616-622. 
17. E.L. Pippen, A.L. Potter, J. Agric . Food. Chem. (1975), 12, 
523-526. 
18. D.H. Defibaugh, J . R. Smith, C.E. l~eeks, J. Assoc. Off. Anal. 
Chem.(1977), 2_0, 522-527. 
19. 0. Pelletier, R. Nadère, J. Food. Sci. (1975), 40, 374-379. 
20. K.L. Huiruri, D.R. Romsos, J.R. Kirk, Am. J. Clio. Nutr., (1974), 
12, 83 7-839. 
21. D.C. Egberg, J. Agric. Food. Chem. (1975), 12, 815-820. 
22. R.B. Torna, H.H. Tabekia, J. Food Sci. (1979), !:!!__, 263-266. 
23. Bognár, Deutsche Lebensm. Rundsch. ( 1981), IJ.... , 431-436. 
24. Food Sci. Techn. A. (1981), ll, 8M 809. 
25. A.T. Rhys Hilliams , H. Slavin, Chrom. Newsl. (1977), 1, 9. 
8211.10 Ho/H 


Literatuuroverzicht analysemethodes voor vitamine B1 en B2

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Name not available

Wageningen Yield

NARCIS