Doel van dit onderzoek is: Het beoordelen omtrent de mogelijke toepassing van FPLC bij het kwaliteitsonderzoek in land- en tuinbouwprodukten. De FPLC apparatuur werd gedurende één week door de fabrikant (Pharmacia) beschikbaar gesteld. In deze korte periode werd de apparatuur gebruikt om een indruk te verkrijgen omtrent de mogelijke bruikbaarheid bij het vleesspeciesonderzoek en bij het onderscheiden van verse en bebroede onbevruchte eieren aan de hand van het eiwitpatroon. De bruikbaarheid van FPLC bij het speciesonderzoek lijkt goed, aangezien tussen waterige extracten van diverse vleessoorten een duidelijk verschil waarneembaar is. Naast het identificeren van vlees moet het mogelijk zijn om in mengsels van rund- en varkenseiwit (gehakt) de afzonderlijke percentages te bepalen. Bij bebroede eieren werd een component, in kleine concentratie, waargenomen, die mogelijk een afbraakprodukt van albumine is. De mogelijkheid om deze component te gebruiken om bebroede eieren te identificeren moet nader onderzocht worden

Cazemier, G.

Elenbaas, H.L.

Haasnoot, W.

Name not available

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)

NARCIS 

Wageningen Yield 

Afdeling Eiwitchemie 
RAPPORT 83.72 
1983-09-28 
Pr.nrs. 505.7020 
404.9100 
Onderwerp: Fast Protein Liquid Chromato-
graphy (FPLC) 
Bijlage: 8 
Verzendlijst: direkteur, sektorhoofd (2x), direktie VKA, afd. 
8372 
Eiwitchemie (4x), afd. Normalisa tie (Humme), 
Projektadministratie, Projektleiders (Cazemier, Elenbaas) 

Afdeling Eiwitchemie 1983-09-28 
RAPPORT 83.72 Pr.nrs. 505.7020 
404.9100 
Projekten: Ontwikkeling en verbetering van onderzoekmethoden voor 
vlees en vleesprodokten 
Onderzoek naar de kwaliteit van pluimvee en eieren 
Onderwerp: Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). 
Doel: 
Het beoordelen omtrent de mogelijke toepassing van FPLC bij het kwali-
teitsonderzoek in land- en tuinbouwprodukten. 
Samenvatting: 
De FPLC apparatuur werd gedurende één week door de fabrikant 
(Pharmacia) beschikbaar gesteld. In deze korte periode werd de appara-
tuur gebruikt om een indruk te verkrijgen omtrent de mogelijke bruik-
baa rheid bij het vleesspeciesonderzoek en bij het onderscheiden van 
verse en bebroede onbevruchte eieren aan de hand van het eiwitpatroon. 
De bruikbaarheid van FPLC bij het speciesonderzoek lijkt goed, aange-
zien tussen waterige extracten van diverse vleessoorten een duidelijk 
verschil waarneembaar is. Naast het identificeren van vlees moet he t 
mogelijk zijn om in mengsels van rund- en varkenseiwit (gehakt) de 
afzonderlijke percentages te bepalen. Bij bebroede eieren werd een 
component, in kleine concentratie , waargenomen, die mogelijk een 
afbraakprodukt van albumine is. De mogelijkheid om deze component te 
gebruiken om bebroede eieren te identificeren moet nader onderzocht 
worden. 
Conclusie: 
Het aanschaffen van FPLC apparatuur lijkt zeker zinvol gezien de 
bruikbaarheid bij het speciesonderzoek en de mogelijke bruikbaarheid 
bij het aantonen van bebroede eieren. 
Deze techniek heeft een aantal voordelen boven de electroforetische 
technieken zoals: 
8372.0 
- snellere scheiding 
- te automatiseren 
- de gescheiden eiwitten kunnen worden uitgevangen ten behoeve van 
bevestigingatechnieken 
- beter geschikt voor het kwantificeren van eiwitten 
- groot scheidend vermogen . 
Naast bovengenoemde wordt gedacht om deze techniek te gebruiken bij de 
hiervolgende onderwerpen: 
- kwalitatief en kwantitatief aantonen van vleesvreemde eiwitten in 
vleesprodukten 
- kaasrijping: het langs chemische weg vaststellen van de rijping van 
kaas aan de hand van het eiwit/peptidepatroon 
- verhitting van melk- en zuivelprodukten: aan de hand van het 
eiwit/peptidepatroon vaststellen van de verhittingsgraad 
- kwaliteit van ~lees: het direct bepalen van het spiervleesgehalte 
aan de hand van specifieke eiwitten (b.v. actine en myosine) 
- isolatie van enzymen: ten behoeve van onderzoek naar de rijpheid van 
tuinbouwprodukten. 
Voor de afdeling Eiwitchemie geeft deze techniek de mogelijkheid om de 
eerst komende jaren nieuw onderzoek te verrichten en bij te dragen aan 
de ontwikkeling van snelle methoden voor het bepalen van parameters 
ten behoeve van het kwaliteitsonderzoek. 
Verantwoordelijk: drs H.L. Elenbaas 
Samensteller: w. Haasnoot 
Projektleiders: G, Caz~r 
8372 .oa 
t6 
en drs H.L. Elenbaas 
Inleiding: 
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) is een techniek welke spe-
ciaal ontworpen is voor het scheiden van biologisc he makro-moleculen , 
zoals eiwitten en polypeptiden. 
Het systeem bestaat uit twee pompen, een programmeerbare gradient-
mixer, een U.V.-detektor, een fractieverzamelaar en een dubbelkanaals-
recorder. 
Het gedeelte welke met de mobiele fase in aanraking komt is gemaakt 
van glas en/of kunststof waardoor het geoorloofd is om grote zoutcon-
centraties te gebruiken. 
Het meest esaentiele onderdeel van het systeem is de kolom. 
Er zijn vier soorten kolomn1en beschikbaar namelijk een sterke anionen-
uitwisselkolom (mono Q), een sterke kationenuitwisselkolom (mono S), 
een zwakke anionenuitwisselkolom (Polyanion Si) en een polybufferuit-
wisselkolom (mono P). 
De kolommen zijn gepakt met harsen die bestaan uit bolletjes welke 
precies even groot zijn (9,8 pm ± 0,4). Door deze zeer kleine spreiding 
in deeltjesgrootte kunnen de kolommen worden gebruikt bij een relatief 
lage druk (maximaal 40 bar) \~aarbij een goede scheiding wordt verkregen 
(schotelgetal 25.000-30.000/meter) . Bij gebruik van de eerste drie 
omschreven kolommen berust de scheiding van eiwitten op het principe 
van de ionchromatografie . 
Bij gebruik van de polybufferuitwisselkolom, met speciaal hiervoor 
ontwikkelde polybuffers als mobiele fase, berust de scheiding van de 
eiwitten op het verschil in iso-electrisch punt. 
Experimenten: 
1. ~p~c_!e~o~d~r~oek: 
Het doel was om verschil in eiwitpatroon van verscheidene rauwe vlees-
soorten te kunnen \~aarnemen aangezien een nauwkeurige identificatie en 
zeker het kwantificeren met behulp van elektroforese in mengsels rauw 
vlees nog problemen geeft. 
Van vier soorten vlees (rund, varken, paard en kip) werden waterige 
extracten gemaakt door aan 5 gram vlees 40 ml water toe te voegen en 2 
minuten te homogeniseren met behulp van een Sorvall mixer. 
8372.1 - 2 -
- 2 -
Na centrifugeren en filtreren werd 100 ~1 extract geinjecteerd op de 
mono Q kolom. 
In figuur 1 worden de chromatagrammen en de chromatografische con-
dities weergegeven en een verschil tussen de soorten vlees is duide-
lijk ,.;raarneembaar. 
Hierbij werd een gradient toegepast waarbij in 6 minuten de con-
centratie natriumacetaat opliep van 0 naar 40%. Dit heeft tot gevolg 
dat de eiwitcomponenten vrij snel achter elkaar elueren . 
Door een minder stijle gradient toe te passen (in 10 min. van 0 naar 
15% NaAc) worden de snel eluerende componenten beter gescheiden en in 
figuur 2 worden de chromatagrammen van de vier vleessoorten weergege-
ven. 
Onder deze condities is een duidelijk verschil waarneembaar tussen de 
vier vleessoorten en een aantal componenten lijkt geschikt om te ge-
bruiken bij het k,.;rantificeren in vleesmengsels. 
Figuur 2a en 2b geven b.v. de mogelijkheid aan om het percentage 
varkenseiwit en rundeiwit in half om half gehakt te kunnen kwantifi-
ceren . Het identificeren en kwantificeren van kip in rauwe vlees-
mengsels is mogelijk vanwege een component die identiek is voor 
kipextracten (zie figuur 2d (*) ) . 
Bij rund- en varkensvleesextracten wordt niet alleen bij snel elueren-
de componenten verschil aangetoond, ook bij later eluerende componen-
ten wordt een verschil waarneembaar indien de gradient wordt aangepast 
(zie figuur 3). 
In figuur 4 worden chromatagrammen '"eergegeven van twee rund- en twee 
varkensvleesmonsters. Hieruit blijkt dat de resultaten reproduceerbaar 
zijn. In figuur 4c wordt een kleine verontreiniging van rundvlees 
waargenomen welke vermoedelijk '"erd geintroduceerd tijdens de injec-
tie. 
Het identificeren van de verschillende pieken was niet mogelijk van-
wege het ontbreken van de geschikte standaarden. Alleen van myoglobine 
werd waargenomen, dat deze in het begin elueert (zie figuur 5). 
In het FPLC systeem kunnen verschillende condities gevarieerd ,.;rorden 
om het resultaat zo mogelijk nog te verbeteren. Zoals gebleken is zijn 
de gradientcondities van groot belang, andere variabelen zijn de buf-
ferkeuze en de kolomkeuze. 
De monsterextractiecondities zijn eveneens van belang. 
8372.2 - 3 -
' ' 
- 3 -
Zo werd bij waterige extracten van acetonpoeders van vlees geheel 
andere chromatagrammen verkregen (zie figuur 6). Het extract van 
varkensvlees vertoont een opvallend triplet aan componenten. In 
figuur 6 wordt een scheiding ~.;reergegeven welke verbeterd kan worden 
door een minder steile gradient toe te passen. 
Door extractie van de vleesmonsters met 7 molair ureum werd getracht 
om meer eiwitten in oplossing te brengen. Bij de monstervoorbewerking 
traden echter problemen op tijdens het overbrengen van monsterextract 
in het eluens (met ureum). Door het pH verschil onstand een troebeling 
door precipitatie van eiwitten welke tijdens het filtreren uit het 
extract werden verwijderd. Het voordeel van het gebruik van ureum werd 
bij de filtratie weer te niet gedaan en het gevolg was dat in het FPLC 
chromatagram ~.;reinig componenten aantoonbaar waren. 
De mogelijkheid van het gebruik van ureumextracten kon dus niet worden 
beoordeeld. 
Een andere techniek ~.;relke met behulp van de FPLC apparatuur kan ~wrden 
uitgevoerd is chromatofocussing, waarbij de scheiding berust op het 
verschil in iso-elektrisch punt. Monsters rund- en varkensvlees werden 
op deze wijze gescheiden en de chromatagrammen worden weergegeven in 
figuur 7. Het gebied waarin de componenten werden gescheiden liep van 
pH 7 tot 4. Een duidelijk verschil tussen varkensvlees en rundvlees is 
waarneembaar. Indien een kleiner pH gebied, b.v. pH 7 tot 5,5, zou 
~wrden toegepast wordt de scheiding vergroot. 
Als snelle scheidingatechniek is chromatofocusing minder geschikt 
aangezien een scheiding ongeveer 1 uur in beslag neemt. Door een 
kleiner pH gradient te nemen is het mogelijk om de analysetijd te 
verkorten tot ca. 30-40 min. 
Gezien de korte testperiode was het niet mogelijk om deze techniek 
meer uitvoerig te testen , toch lijkt de mogelijkheid aanwezig om deze 
te gebruiken bij de identificatie van vleesmonsters. 
2. Bebroede eieren: 
Het doel ~.;ras te kunnen beoordelen of er verschil in eiwitpatroon 
tussen verse en bebroede eieren aanwezig is om eventueel onbevruchte, 
bebroede eieren te kunnen herkennen. 
8372.3 - 4 -
- 4 -
Volgens de literatuur is het in eieren voorkomende ovalbumine gevoelig 
voor warmte. Met electraforese is m.b.t. dit eiwit een verschil waar-
neembaar tussen verse en bebroede eieren. Bij bebroede eieren treedt 
een verbreding van de ovalbumineband op. Getracht werd om dit met 
behulp van FPLC te kunnen waarnemen. 
Hiervoor ~o1erd 10 gram eimonster geextraheerd met 40 ml wate r, na 2 min 
homogeniseren met behulp van een Ultra-Turrax en na centrifugeren en 
filtreren van het supernatant ~o1erd 200 ~1 geinjecteerd. De resultaten 
worden weergegeven in figuur 8. Bij bebroede eieren wordt naast 
ovalbumine een tweede kleine piek ~o1aargenomen welke vermoedelijk een 
afbraakprodukt is van ovalbumine. 
In de toekomst moet getracht ~.,orden om een betere scheiding te be~o7erk­
stelligen door b.v. een andere buffer te gebruiken waarna eventueel 
meer monster kan ~o1orden geintroduceerd om het afbraakprodukt van 
ovalbumine beter te kunnen detecteren. Door het analyseren van meer-
dere monsters kan dan beoordeeld worden of deze snelle methode 
gebruikt kan worden voor het aantonen van onbevruchte bebroede eieren 
als zodanig. 
8372.4 Ha/t~ 
Figuur 1: Chromatogrammén van wate rige exttact~n van vers vlees 
l(olom : mono Q. 
Eluens : A 0,02 mol BisTris pH 6,4 
B 0,02 mol BisTris + 1 mol natriumacetaat pH 6,4 . 
Flow 2 ml/min. 
Speed : 0,5 cm/ml. 
__ ., :_ ._. lrü!f~t~~voll.ll!! · . 00 \,.ü. 
' · o 
---· r·- -8 - - ·--- -
a . rund 
, - -- -· =--- . . -
~ 
::; 
' ~ 
~ 
., 
~ 
~ 
_, 
" 
c. paard 
. r - , g --:-. -~ . -
I 
' 
·· à- -
-- 8 - ·· 
.. , 
·o· . 
-: ~ : -
i 
I 
I 
.. 
l t:\ 
ro· 
: ,_ 
. -- .-•o 
,; 
b. varken 
. -~---
l_ 
' 
d . kip 
. ' . 
Figuur 2: chromatagrammen van waterige extracten van vers vlees onder 
de condities zoals· beschreven in figuur 1, behalve de gradiënt. 
- ·--.----,-- - ·· --
. - -- - ------- --- - --
- - • I 
-a -
~r 
,, 
:o 
. ;:; 
,. ;o 
' ~ !0 
. " :o 
a . rund 
1·-
I 
I. 
I 
c . paa rd 
;;----
0 . 
'" 0 
•.· 
-
..... 
I 
· ~ 
• o 
i 
I 
-··--.-. I. I 
b. varken 
* · -- .. . . 
cl. kip 
~--
I • 
'·' . "_ 0 
Figuur 3: chromatagrammen van waterige extracte n van vers vlees onder de 
condities zoals beschreven in figuur 1 (flow 1,5 ml/min). 
:~-:s-: -~-- :· --
. . . 
a . rund 
~· - ... . --__....,-- -·-- · 
. -- · ·- . -· . -- . 
1 
I 
I 
l 
b . varken 
.:; --- ----
cj · - --
· '.j 
-~ 
. : - -::-!:""===== 
- - - t~­
·-- - ---- -
- I 
' I 
Figuur 4 : chromatagrammen w~terige extracten van vers vl~es onder de condities 
zoals beschreven in figuur 1: uitzondering flow 1,5 ml/min. 
. . 
: : - : I- : 
• • • • t • • 
. -- ---- --- · -
-· y 
... . "" ï . 
rundvlees 26458 
- 4- ~ -:-·- :-- - -
. . .. . 
~~--- .. :3-=-= - _ -L ,,: 
, 
., 
-
-
I ,_ 
I . 
! 
~ 
• > 
.-. 
-- - · 
--
-: 
-
-
I I \ -I , . Ir : , 
Vj l_ 
varkensvlees 26432 
:)'1! -
. . 
I 
.. 
. ,
<> 
·----- - ' > 
:-:. ~ :. -:~ -.:.:: 
_, . . 
~ . 
. :t 
.. - . 
----
rundvlees 26455 
~-
::: . 
'"'t • --------- - -·. - - -
~, ·- . : 
-~ 
' ' I 
. I 
. . I 
- . ... . 
I ~
varkensvlees 26431 
' - . 
. . ' 
. - . .: 
--· 
- --· · 
.. . 
. . 
Figuur 5 : chromatagram van 100 ul standaardopl. van 
myoglobine (Sperm Whale) mèt een conc. van 
268 ug/ml onder de condities beschreven in 
figuur 1. 
- --- --- --~ ----- •:1 -· 
myogl(lbine 
:., 
,- ._; 
·B 
., 
· -::; 
':! 
Figuur 6: chromatogr~mmen van waterige extracten van a6etonpoeder onder 
de condities zoals beschreven in figuur 1. 
g - - - - - -
.. 
- I 
a. rund 
- : ~ 
~ ·-
-
,I 
. ~ . 
- ~ I; 
,I 
!I ,, 
- r 
-~ I ~. 
!I 
~ :I 
.,- ;'::i 
b. varken c . kip 
Figuur 7: waterige e~tracteri van vers vlees l 280 nm 
l<olom : mono P. 
a. rund 
b. varken 
Startbuffer: 0,025 mol Bis-Tris pH 7. 
Eluens: polybuffer 7,4 pH 4. 
~  
I 
\. 
I 
.I 
I 
i ' 
.. d 
~ 
' . 
l 
! 
.. 
·< _,
I 
è 
' 
'i:. 
: I 
. I 
' 
- ~ . . . . .. -
.J 
- ~ 
-
·~ 
';,1 
ö --
; 
0 
Figuur 8: Waterige extracten van 
l<olom : mono Q. 
Eluens: A 0,02 molTris 
Flow 
Speed 
B 0,02 moLTris 
2 ml/min. 
0,5 cm/ml 
a. extract van vers ei 
eieren en siandaard 
buffer pH 8. 
buffer + 1 mol NaCl 
c . standaardoplossing van 
ovalbumine 0,1 mg/ml 
injectievolume 100 ul. 
ovalbumine. 
Á : 280 nm . 
AUFS: 0, l. 
pH 8 . 
b. extract van 18 daags bebroed e: 


http://library.wur.nl/WebQuery/wurpubs/fulltext/251393

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Name not available

NARCIS

Wageningen Yield