Voor het opstellen van een normvoorschrift voor de bepaling van de antioxydanten BHA, BHT en TBHQ in botervet worden door werkgroep E43 van de "International Dairy Federation" methoden geëvalueerd. Uitgangspunt voor deze norm is de gaschromatografische bepaling beschreven in ISO 6463-1982. De wens bestaat echter om gebruik te maken van capillaire gaschromatografie, dit in afwijking van ISO 6463

Hollman, P.

Kamp, H., van der

Slangen, J.

Traag, W.

Wageningen Yield 

Project 505.0290 
Normalisatie/harmonisatie bepaling additieven in levensmiddelen 
Rapport 87 . 64 September 1987 
CLEAN UP PROCEDURE (GPC) VOOR DE GC 
BEPALING VAN DE ANTIOXIDANTEN BHA , BHT 
EN TBHQ IN BOTERVET 
J, Slangen 
Afdeling Additieven/Micronutri~nten 
Medewerkers: w. Traag , H. van der Kamp 
Goedgekeurd door: ir P. Hallman 
Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouwprodukten (RIKILT) 
Bornsesteeg 45, 6708 PO Wageningen 
Postbus 230, 6700 AE Wageningen 
Telefoon 08370-19110 
Telex 75180 RIKIL 
8764 
VERZENDLIJST 
INTERN: 
directeur 
sectorhoofden 
\oJ. Traag 
H. v.d. Kamp 
Sledsens 
bibliotheek 
circulatie 
projectbeheer 
EXTERN: 
Agralin, Pudoc 
directie DLO-Algemeen 
Overname van de inhoud is toegestaan, mits met duidelijke bronvermelding. 
8764.0 
I 
ABSTRACT 
CLEAN UP PROCEDURE (GPC) VOOR DE GC BEPALING VAN DE ANTIOXIDANTEN 
BHA, BHT en TBHQ IN BOTERVET 
CLEAN UP PROCEDURE (GPC) FOR THE GC DETERHINATION OF THE ANTIOXIDANTS 
BHA, BHT AND TBHQ IN BUTTERFAT (in Dutch) 
Report 87.64 September 1987 
J, Slangen 
State Institute of Quality Control of Agricultural Products (RIKILT) 
PO Box 230 , 6700 AE Wageningen, the Netherlands 
1 table, 7 figures, 3 references 
A Gel Permeation Chromatographic (GPC) clean up procedure prior to the 
GC determination of the antioxidants BHA, BHT and TBHQ in butterfat 
was studied . The procedure proves to be sufficient in removing the fat 
components; no interterences were observed on the capillary GC column. 
However , recovery experiments with spiked butterfat show losses of 
antioxidants up to 35%, due to incomplete separation between ant i oxi-
dants and f at components on the GPC column. 
Keywords: antioxidants, BHA, BHT, TBHQ, butterfa t, GC, GPC clean up 
8764.0a 
INHOUD 
ABSTRACT 
SAHENVATTING 
1 INLEIDING 
2 NATERIAAL EN NETHODE 
2 .1 GPC-systeem 
2.2 CC-systeem 
2.3 Standaarden 
2.4 Extractie en cleanup 
II 
2 . 5 Bereiding monste rs met een bekend 
gehalte aan BHA , BHT en TBHQ 
3 RESULTATEN EN DISCUSSIE 
4 CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN 
LITERATUUR 
BIJLAGEN 
8764.0b 
bl z 
I 
lil 
1 
2 
2 
2 
2 
3 
3 
3 
4 
6 
III 
SAHENVATTING 
Voor het opstellen van een normvoorschrift voor de bepaling van de 
antioxydanten BHA, BHT en TBHQ in botervet worden door 1verkgroep E43 
van de "International Dairy Federation" methoden geëvalueerd . Uitgangs-
punt voor deze norm is de gaschromatografische bepaling beschreven in 
ISO 6463-1982. De wens bestaat echter om gebruik te maken van capil-
laire gaschromatografie , dit in afwijking van ISO 6463. Uit een eerder 
uitgevoerd oriënterend onderzoek bleek dat interferenties van het vet 
op de capillaire kolom de bepaling van de antioxydanten storen. 
In het hier beschreven onderzoek wordt de toepasbaarheid van gelper-
meatiechromatografie (GPC) voor de cleanup van de monsterextracten 
bekeken . Aangezien de hoeveelheid vet die per injectie op de GPC-kolom 
gebracht kan worden beperkt is, en bij de elutie van de antioxydanten 
een verdunning optreedt is de hoeveelheid antioxydant die uiteindelijk 
op de GC-kolom ge'injecteerd kan worden kleiner dan de detektiegrens. 
Uit dit onderzoek blijkt dat splitless injectie op de capillaire kolom 
betrouwbare resultaten levert, en aldus het probleem van de detek-
tiegrens opgelost wordt. 
De scheiding tussen antioxydanten en de vetmatrix op de GPC-kolom 
blijkt niet volledig te zijn. Dit geeft aanleiding tot verliezen van 
antioxydanten bij de analyse van monsters botervet . 
Recovery-experimenten met monsters botervet en ghee waaraan 50, 100, 
200 en 300 mg/kg van elk der antioxydanten IHlA, BHT en TBHQ is toe-
gevoegd , geven een verlies van maximaal 35% (zie tabel 1) . Uit 
herhaalde injectie van monsterextracten van botervet op de GC-kolom, 
nadat de GPC-cleanup is toegepast, blijkt dat geen interferenties meer 
optreden. Hieruit kan geconcludeerd worden dat de GPC-cleanup van de 
monsterextracten voldoende is . 
Aanbevolen wordt het GPC-systeem te optimaliseren. 
8764.0c 
- 1 -
1 INLEIDING 
In Group E43-Selected food additives, van de Internationale Dairy 
Federation (IDF) wordt gewerkt aan het opstellen van een standaard-
methode voor de bepaling van antioxydanten (BHA, BHT, TBHQ) in 
bote rvet. Als uitgangspunt voor deze standaard werd destijds gekozen 
voor de internationale standaard ISO 6463-1982: Animal and vegetable 
fats and oils - Determination of BHA and BHT - Gas-liquid chromato-
graphic rnethod. 
Toepassing van ISO 6463 bij botervet, waarbij in plaat s van de voor-
geschreven gepakte kolom een capillaire kolom ~-1erd gebruikt, gaf 
echter problemen tengevolge van inteferentie van he t vet op de 
capillaire kolom. Zo bleek dat de piekvorm van TBHO na een aantal 
injecties verslechterde, bovendien ~<~as de recovery van BHA te hoog. 
Terugkeer naar gebruik va n een gepakte kolom ~<~erd niet acceptabel 
geacht door Group E43. Daarom werd besloten diverse clean-up proce-
dures ter verwijdering van het vet voorafgaande aan de gaschromatogra-
fische analyse, te bestuderen. 
In het hier beschreven onderzoek wordt de toepasbaarheid van gelper-
mea tiechromatografie (GPC) voor de verwijdering va n het vet onder-
zocht. Het bestudeerde GPC-systeem wordt al geruime tijd routinematig 
toegepas t bij de bepaling van PCB ' s in diverse produkten . Aa ngezien 
dit GPC-systeem een maxima l e capacitei t van 100 mg vet pe r injectie 
heef t e n voor de elutie van de antioxydanten van de GPC- kolom ongeveer 
10 ml oplosmiddel nodig is, ontstaat er een detektieg r e ns probleem. 
Indampen van het GPC-eluaat geef t niet de gewenste oplossing, aange-
zien uit de literatuur (1,2,3) blijkt dat met verliezen rekening 
gehouden moet worde n. Daarom werd gekozen voor splitless injectie op 
de capillaire kolom. In dit onderzoek wordt tevens nagegaan of split-
less injectie mogelijk is. 
8764 .1 - 2 -
- 2 -
2 NATERIAAL EN ~lETHODE 
2.1 GPC-systeem 
Het GPC-systeem bestaat uit: 
- injectieautomaat (HISP, ?lOB-Haters), injectievolume 1000 ).11 
- pomp (N-45 Haters) flow 1,0 rul/min 
- eluens ethylacetaat-cyclohexaan 1:1 (v/v) 
- kolom Bio- Beads S-X3 (Biorad) lengte 450 mm, ID 10 ).lm, T=40°C 
- UV- detector (LC3UV, Pye Unicam) golflengte= 280 nm 1,20 Aufs 
- recorder (BD- 40, Kipp en Zonen) 
- fractieverzamelaar (Ultrarac II 2070, LKB) 
2.2 GC-systeem 
Het GC-systeem bestaat uit: 
- apparaat: Varian 3700 
- kolom: fused silica CP Sil 5GB 12,5 m x 0,22 mm ID 
filmdikte 0,12 ).lm 
- injectie: splitless T=l50°C , volume = 1 ).11 
- temperatuurprogramma: 60 tot 115°C met l0 °C/min. 
- detector: FID T=250°C 
- druk: 0,8 atm . He 
- intergratiesysteem: SP-4000 (Spectra Physics) 
- recorder: BD- 41 (Kipp en Zonen) 
2.3 Standaarden 
Bij de GC wordt tetradecaan gebruikt als interne standaa rd (IS). Heeg 
af ca. 200 mg tetradecaan, los op in ethylacetaat, vul aan tot 50 ml 
en me ng. Pipeteer hie ruit 1 ml in een kolf van 1000 ml, vul aan en 
meng (concentratie IS ca . 4 ).lg/ml). 
l~eeg van BHA, BHT en TBHQ 250 ,0 rug af i n een maatkolf van 50 ml, los 
op in ethylacetaat , vul aan en meng (=stock oplossing). Pipeteer hier-
uit 0, 250, 500, 1000 en 1500 ).11 in een maatkolf van 25 ml, vul aan en 
meng. Pipeteer hie ruit 1 rul in een kolf van 10 rul, vul aan en meng. 
Pipeteer tenslotte hieruit 1 ml in een maatkolf van 10 ml, voeg toe 
1,00 ml inte rne standaard, vul aan en me ng (concentratie= 0, 0,5, 1, 
2, 3 ).lg/ml + 0,4 ).lg/rnl IS elk) . 
Maak deze oplossingen dagelijks vers. 
8764.2 - 3 -
- 3 -
IJklijn: 
Injecteer elke standaardoplossing in het GC-systeem en bepaal de 
verhouding (ratio) van de piekoppervlakte van het betreffende antioxy-
dant ten opzichte van het piekoppervlak van de interne standaard. 
Zet grafisch de berekende verhoudingen uit tegen de concentraties 
(zie figuur 1) . 
2 . 4 Extractie en clean up 
Weeg 1,000 g gesmolten botervet of ghee af in een maatkolf van 10 ml, 
los op in ethylacetaat, vul aan en meng. Injecteer hiervan 1000 pl in 
het GPC-systeem en start het opvangen van de antioxydanten fractie op 
een vast tijdstip (17 ' 20'') . Voeg hieraan 1 , 00 rul interne standaard 
toe vul aan tot 10 rul en meng . Injecteer hieruit 1 pl in het Ge-
systeem en bepaal de verhouding van de piekoppervlakte ten opzichte 
van de piekoppervlakte van de interne standaard. Lees uit de stan-
daardlijn de bijbehorende waarde van de concentratie af en bereken 
hieruit het gehalte in het monster rekening houdend met de verdunning 
en de inweeg. 
2 . 5 Bereiding monsters met een bekend gehalte aan BHA, BHT en TBHQ 
Weeg vijf maal 25,00 gram gesmolten botervet of ghee af in een erlen-
meyer van 100 rul met ingeslepen stop . Voeg respectievelijk toe 0,250, 
500,1000 en 1500 pl van de standaardstockoplossing (zie boven) sluit 
goed af en zwenk voorzichtig goed om. Het monster bevat nu respec-
tievelijk 0,50,100,200 en 300 mg/kg van elk antioxydant . 
3 RESULTATEN EN DISCUSSIE 
In figuur 1 zijn de ijklijnen weergegeven van de afzonderlijke anti-
oxydanten met de bijbehorende correlatieco~fficiänten, die groter dan 
0,996 zijn . Splitless injectie van de antioxydanten op dit systeem 
blijkt dus te voldoen. 
De scheiding tussen antioxydanten en de botervet-matrix wordt weerge-
geven in de GPC-chromatogrammen 1 t/m 3. Een volledige scheiding 
tussen antioxydanten en de komponenten uit het botervet wordt niet 
bereikt . Als echter begonnen wordt met het verzamelen van de antioxy-
danten na 17 min. 20 sec., blijkt echter dat nagenoeg geen vetmatrix 
8764.3 - 4 -
- 4 -
interferenties meer optreden op de capillaire kolom. Dit wordt weerge-
geven in GC-chrom. 1 t/m 3, waarbij GC-chrom. 3 opgenomen is nadat 
diverse injecties van boterve textracten (met GPC-cleanup) op de kolom 
hadden plaatsgevonden. Het valt op dat in tegenstelling tot vroegere 
e xperimenten zonder cleanup, de piekvorm van TBHQ nu wel onveranderd 
blijft, nadat diverse extracten op de kolom ge'injecteerd zijn. 
In tabel 1 staan de resultaten vermeld van de recovery-experimenten. 
De recovery in mg/kg en in procenten van de afzonderlijke antioxydan-
ten is weergegeven voor de verschillende additieniveaus aan botervet 
en ghee en van een standaardmengsel. Er is geen correctie van het 
volume van de additie uitgevoerd. De overall gemiddelde recovery voor 
BHA, BHT en TBHQ op de verschillende niveaus in botervet en ghee 
bedraagt respectievelijk 80, 78 en 69%. Het verlies aan antioxydanten 
kan ,.,aarschijnlijk verklaard 'wrden uit het feit dat bij de GPC de 
ve tfractie niet basislijn gescheiden is van de antioxydanten fractie . 
Daarbij is gekozen voor een dusdanig uitvang tijdstip voor de an ti-
oxydanten fractie dat het aldus verkregen eluaat zo weinig mogelijk 
vet bevat dat de GC- kolom kan vervuilen (zie GPC-chromatogram 1 t/m 3) . 
De r ecove ry van de pure s tandaardmix t e ndee rt naar lagere waarden t en 
opzichte van de mons ters met additie (tabel 1). Een mogelijke verkla-
ring is da t de r e t entie van de antioxydantenfractie op de GPC-kolom 
be'invloed wordt door de aamo1ezigheid van het vet. Het opvangen van de 
antioxydantenfractie is gedurende alle experimenten s teeds gestart op 
d ezelfde tijd (17 ' , 20"), zodat varia bele verliezen mogeli jk zi jn . 
Uit de GC-chromatogrammen blijkt dat bij de monsters een storend 
piekje verschijnt voor de interne standaard. De eventuele invloed 
hiervan op de recovery kan verkl e ind worden 6f door de concentratie 
van de interne standaard te ve rhoge n 6f door een andere interne stan-
daard te kiezen . 
4 CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN 
GPC biedt perspectieven als clean-up procedure bij de be pa ling van 
BHA, BHT e n TBHQ in bote rvet en ghee met behulp van capillaire GC . De 
hierbij noodzakelijke splitless injectie op de capillaire kolom geeft 
betrouwbare resultaten. Bij de onderzochte GPC-kolom treden verliezen 
aan antioxydanten op veroorzaakt door een onvolledige scheiding tussen 
antioxydanten en de vetmatrix componente n. 
8764 . 4 - 5 -
- 5 -
Het verdient aanbeveling het GPC-systeem verder te onderzoeken, ~vaar­
bij de volgende punten aandacht behoeven. De hier gerapporteerde 
verliezen aan antioxydanten tengevolge van de onvolledige scheiding op 
de GPC-kolom zouden ondervangen kunnen ~vorden door introductie van een 
geschikte interne standaard, die hetzelfde retentiegedrag vertoont als 
de antioxydanten op de GPC-kolom. Een t~veede mogelijkheid is te zoeken 
naar een GPC-systeem waarmee wel een volledige scheiding tussen anti-
oxydanten en vetmatrix mogelijk is. 
8764.5 - 6 -
- 6 -
LITERATUUR 
1 . Stijve, T., Disereus, J.M. Deutsche Lebensmittel- Rundschau 79 (4) 
(1983), 108. 
2. Page, B.D., J , Assoc . Off , Anal. Chem . ~ (3) (1983), 727 . 
3 . Van Peteghem, C.H., Dekeyser, D.A., J, Assoc. Off, Anal. Chem. 64 (6) 
(1981), 1331. 
8764.6 Sla/IH 
BIJLAGE A 
Tabel 1 : Recove r yexperimenten 
Recovery BHA Recovery BHT Recover y TBHQ 
mg / kg % mg/ kg % mg/kg % 
Standaard 200 mg/kg 146 73 142 71 122 61 
Botervet + 300 mg/ kg 251 84 253 84 229 76 
+ 200 mg/kg 142 71 142 71 127 64 
+ 100 mg / kg 77 77 75 75 65 65 
+ 50 mg/kg 40 79 39 78 32 65 
Ghee + 300 mg/kg 248 82 244 81 221 74 
+ 200 mg/kg 166 83 159 79 145 72 
+ 100 mg/kg 82 82 79 79 69 69 
+ 50 mg/kg 42 84 39 78 35 69 
8764. 7 Sla/IH 
----- ----·· --
I 
-- -i . 
I 
}.. 
0 
fl ~ - -- ---
') 
~-
~ 
'I ,. 
~ 
~ 
~ 
.... 
'\ 
~ ~ ~ 
-- ---~-
-:~ - . 
- - - -·-- - ·-----~ -! (J 
--...~:·~~- . 
~ ~ ~ 
~ ~ 
~ ~ ,.. 
" ~ 
,I) 
" ~ ,() 
~ 
-() ~ ~ -~ 
~ ~ 
l• ,, 
,{) ~ ~ ~ .... 
~ ~ -. 
~ ~ 
~ ,, 
~ 
.... 
\\ 
.. ~ 
~ 
~ 
~ 
~ 
~ 
'~ ~ 
~ 
~ 
~ 
11 
-· oP 
c 
c ,. 
~ 
. 

'(\ 
~ 
-- --
~ 
~ 
~ 
'l \) 
.(\ 
~ 
~ 
~ 
~ 
t' I'/ <: · /;l Zo 

: ,. .... ~,... ..; ... _ . .,. ··•.J• r: · •. 
GC.-c.k.o-wt.1. 
Btv{.-1~  + ;J.iJo ~ / ~ ~ • 
~~ GPC ~~ 
J.:t dP1;• l-·.~• 
90 U6H 6 7.t09Nt908? 
! 
i 
I 
---.~l 
&c. - ~W'\. 3 
J..oo '--~ /~ ~oL 
-...bo.J:. ___ _ 
060~ 


Clean up procedure (GPC) voor de GC bepaling van de antioxidanten BHA, BHT en TBHQ in botervet

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Wageningen Yield

Name not available