Early stages in cowpea chlorotic mottle virus infection

Abstract

Virussen zijn infectieuze eenheden, bestaande uit nucleïnezuren welke omgeven zijn door een eiwitmantel en eventueel een membraan. Voor wat betreft hun vermenigvuldiging zijn virussen afhankelijk van een levende gastheercel, waarbij ze over het vermogen moeten beschikken deze binnen te dringen, zich erin te vermenigvuldigen en zich vervolgens naar andere cellen te verspreiden.Gedurende de laatste decennia is onze kennis over virussen en hun vermogen tot infectie enorm toegenomen. De opkomst van de moleculair- en celbiologische technieken heeft bijgedragen tot een gedetailleerde kennis van zowel de organisatie van het virale genoom, als de mechanismen die aan de expressie en replicatie ervan ten grondslag liggen. Daarnaast hebben biofysische studies informatie verschaft over de structuur en assemblage van het virale deeltje. De kennis over de initiële stadia van het infectieproces, het binnendringen in de gastheercel en de ontmanteling van het virale genoom bleef echter zeer schaars. Het feit dat in veel gevallen slechts enkele virusdeeltjes verantwoordelijk zijn voor infectie heeft vooral bestudering van de initiële interacties tussen virus en gastheercel aanzienlijk bemoeilijkt.Dit proefschrift beschrijft het onderzoek verricht aan deze initiële stadia van virusinfecties bij planten. Twee vragen stonden hierbij centraal: (1) hoe en in welke vorm dringt een plantevirus een te infecteren cel binnen en (2) welk mechanisme is verantwoordelijk voor de ontmanteling van het virale genoom? Als model voor dit onderzoek is gekozen voor cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) en geïsoleerde cowpea ( Vigna unguiculata ) mesophyl protoplasten. Een aantal eigenschappen van dit modelsysteem zijn weergegeven in de inleiding (Hoofdstuk l).Met betrekking tot de initiële interacties tussen virus en gastheercel is voor zowel dierals plantevirussen een beknopt literatuuroverzicht gegeven van de tot nu toe bekende mechanismen (Hoofdstuk 2). Zowel op het niveau van de binding aan het celoppervlak, het binnendringen in de gastheercel, als ook op het niveau van de ontmanteling van het virale genoom, zijn verschillen en overeenkomsten tussen dier- en plantevirussen belicht. De meest opmerkelijke verschillen werden aangetroffen bij de binding en binnendringing van de gastheercel. Is voor de meeste diervirussen binding aan specifieke componenten van de plasmamembraan (receptoren) noodzakelijk voor penetratie, voor plantevirussen lijkt alleen een beschadiging van de plasmamembraan voldoende.Om na te gaan in hoeverre ook voor plantevirussen (specifieke) interacties met membraancomponenten van belang zijn voor infectie van de cel, is de binding van CCMV aan cowpea protoplasten -bestudeerd in relatie tot binnendringing en infectie (Hoofdstuk 3). Uit de resultaten van dit onderzoek bleek dat de binding van CCMV aan geïsoleerde protoplasten gebaseerd is op (aspecifieke) elektrostatische interacties, terwijl penetratie afhankelijk is van mechanische beschadiging van de plasmamembraan. Tevens zijn aanwijzingen verkregen dat virusdeeltjes, welke middels endocytose worden opgenomen, niet betrokken zijn bij infectie van de cel. Uit deze gegevens werd geconcludeerd dat alleen die virusdeeltjes, die via membraanbeschadigingen direct in het cytoplasma van de gastheercel terecht komen, verantwoordelijk zijn voor infectie. Ten gevolge hiervan moet worden verondersteld dat ontmanteling van het virale genoom intracellulair plaatsvindt.Aangezien voor het tabaksmozaïekvirus (TMV) inmiddels sterke aanwijzingen waren verkregen dat cytoplasmatische ribosomen een rol spelen bij ontmanteling van het genoom middels "cotranslational disassembly", werd nagegaan in hoeverre dit mechanisme ook van toepassing zou kunnen zijn op CCMV. "Cotranslational disassembly" veronderstelt dat ontmanteling plaatsvindt gelijk-tijdig met translatie van het virale genoom, waarbij in het geval van TMV het virusdeeltje vooraf zodanig behandeld moet worden dat het 5'-uiteinde van het RNA beschikbaar is voor initiatie van translatie.Door in eerste instantie gebruik te maken van celvrije translatiesystemen werden aanwijzingen verkregen dat ook voor CCMV "cotranslational disassembly" een rol zou kunnen spelen bij de ontmanteling (Hoofdstuk 4). Na toevoeging van intacte virusdeeltjes aan dergelijke systemen werd synthese van virus specifieke eiwitten waargenomen. Bovendien kon de aanwezigheid van translationeel actieve virus-ribosoom complexen worden aangetoond.De interactie tussen CCMV en ribosomen werd vervolgens nader geanalyseerd op eiwitniveau (Hoofdstuk 5). Hiertoe werden electroblots van ribosomale eiwitten, gescheiden onder denaturerende omstandigheden, geïncubeerd met virus, en werd het gebonden virus met behulp van immunologische methoden zichtbaar gemaakt. Ongeveer twintig eiwitten, behorend tot zowel de grote als kleine ribosomale subeenheden, bleken virus en/of viraal mantel-eiwit te binden. Dezelfde ribosomale eiwitten bleken eveneens betrokken te zijn bij binding van een aantal andere plantevirussen. Hoewel de beschreven experimenten hierover onvoldoende uitsluitsel geven, zou de waargenomen binding van virus aan deze ribosomale eiwitten op een functionele rol kunnen duiden.Naast deze analyse op eiwitniveau is tevens gekeken naar de rol van "cotranslational disassembly" in de ontmanteling van CCMV in vivo (Hoofdstuk 6). Op verschillende tijdstippen na inoculatie werden met CCMV geïnoculeerde cowpea protoplasten gelyseerd en vervolgens geanalyseerd op de aanwezigheid van virus-ribosoom complexen. Inderdaad werden virus-ribosoom complexen aangetroffen, echter in tegenstelling tot in vitro, kon hun translationele activiteit in vivo niet worden aangetoond. Hiervoor wordt een aantal mogelijke verklaringen gegeven. Anderzijds benadrukten ook deze resultaten nogmaals de sterke affiniteit tussen CCMV en ribosomen, en werden aanwijzingen verkregen dat de vorming van virus-ribosoom complexen vooraf zou kunnen gaan aan een eventuele initiatie van "cotranslational disassembly".Tenslotte zijn de in de diverse experimentele systemen verkregen gegevens samengevat in een model (Hoofdstuk 7, Figuur l). Dit model beoogt een beeld te geven van die gebeurtenissen die van toepassing zijn op de wellicht minder dan 0,01 % van de virusdeeltjes die verantwoordelijk zijn voor infectie van de cel. Met name daar waar het de interactie tussen virusdeeltje en ribosoom betreft, voorafgaand aan de initiatie van "cotranslational disassembly", bestaan nog veel vraagtekens. Een verdere ontrafeling van deze complexe interacties, alsmede het aantonen van "cotranslational disassembly" van CCMV in vivo. kunnen bijdragen tot een beter begrip van de initiële stadia van virusinfecties bij planten.</p