Characterization of the viral proteins involved in the RNA replication of cowpea mosaic virus

Abstract

Veel virussen die planten of dieren infecteren hebben enkelstrengs RNA moleculen met een positieve polariteit als drager van hun genetische informatie. Genomische RNA moleculen met positieve polariteit, of (+)-strengs RNA, betekent dat deze RNA moleculen in de cel van de gastheer gebruikt worden als boodschapper RNA voor de productie van virale eiwitten. Deze eiwitten maken dan de verschillende stappen in de levenscyclus van het virus mogelijk, zoals de vermenigvuldiging van het virale RNA (replicatie), het inpakken van dit RNA in eiwitmantels en de verspreiding van het virus van geïnfecteerde cellen naar andere, nog niet geïnfecteerde cellen. Verschillende groepen (+)-strengs RNA virussen volgen bij het tot stand brengen van deze stappen elk hun eigen strategie. Een groot aantal van de (+)-strengs RNA virussen zijn op grond van overeenkomsten in organisatie van de genetische informatie en de manier waarop die informatie tot expressie komt en wordt gerepliceerd ingedeeld in twee supergroepen; de picorna-achtige virussen en de Sindbis- of alpha- achtige virussen (hoofdstuk l). Tot de supergroep van picorna-achtige virussen behoren onder andere het humane poliovirus en mond- en klauwzeer virus, -beide picornavirussen-, en de plantevirussen van de cornovirus groep. Tot die laatste groep behoort cowpea mosaic virus (CPMV), dat als gastheer de cowpea (kouseband) plant heeft. Het doel van het onderzoek in dit proefschrift was meer inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen die optreden bij de RNA replicatie van CPMV. Gedurende het onderzoek werd regelmatig een vergelijking gemaakt tussen het mechanisme van RNA replicatie van CPMV en van poliovirus.Het genoom van CPMV bestaat uit twee RNA moleculen met een lengte van 5805 en 3299 nucleotiden, respectievelijk B- en M-RNA genaamd, die afzonderlijk zijn verpakt in een eiwitmantel. Beide RNAs bezitten aan het 5' eind een klein eiwit, VPg, en een poly(A) staart aan het 3' einde. Translatie van deze RNAs leidt tot de synthese van grote poly-eiwitten, die proteolytisch in verschillende functionele eiwitten geknipt worden. Voor een succesvolle infectie van planten zijn eiwitten afkomstig van beide genomische RNA moleculen van CPMV noodzakelijk, maar er is een duidelijke verdeling van taken die de B- en M-RNA-gecodeerde eiwitten vervullen in het infectie proces. Zo codeert M-RNA voor alle functies die nodig zijn voor de verspreiding van het virus door de plant, en B-RNA voor alle virale eiwitten die nodig zijn voor de replicatie van de virale RNA moleculen. Translatie van M-RNA geeft, afhankelijk van het gekozen start codon, een poly-eiwit van 105K of 95K, waarbij de aminozuur volgorde van het 95K eiwit volledig identiek is aan het carboxy- terminale einde van het 105K eiwit. Volledige klieving van deze M poly-eiwitten geeft de 58K/48K transport eiwitten en de 37K en 23K manteleiwitten. Het primaire translatieproduct van B-RNA, het 200K poly-eiwit, wordt onmiddelijk na of zelfs al tijdens de synthese gekliefd in de 32K en 170K eiwitten. Het 170K eiwit kan vervolgens op verschillende manieren verder gekliefd worden en geeft dan de 60K en 110K, 84K en 87K of 58K en 112K eiwitten. Volledige klieving van het B-RNA- gecodeerde 200K poly-eiwit geeft de 32K, 58K, VPg, 24K en 87K eindproducten, die in deze volgorde in het 200K poly-eiwit bevat zijn.De replicatie van (+)-strengs RNA virussen volgt in grote lijnen eenzelfde schema. Eerst worden de genomische RNAs als matrijs gebruikt voor de synthese van een complementaire streng (de (-)streng), die vervolgens weer als matrijs dient voor de synthese van nieuwe (+)-strengen. De exacte functie van de B-RNA-gecodeerde eiwitten in het RNA replicatie proces is echter maar ten dele bekend of is alleen gebaseerd op aminozuur sequentie homologie met eiwitten waarvan de functie reeds bekend is. Het 32K eiwit is een co-factor in de klieving van de M-poly-eiwitten en is ook betrokken in de regulatie van de klievingen van het B-poly-eiwit. Het 24K eiwit is het actieve protease dat alle klievingen van de CPMV eiwitten uitvoert. Het 87K eiwit bezit homologie met RNA polymerases; enzymen die in staat zijn nieuwe RNA strengen te synthetiseren. Het 87K eiwit vormt samen met het 24K eiwit het 110K eiwit, dat vermoedelijk de actieve vorm van het polymerase is in RNA replicatie complexen. Het 58K eiwit, dat tesamen met VPg het 60K eiwit vormt, zou op grond van homologie in aminozuur volgorde een RNA helicase kunnen zijn, noodzakelijk voor het ontwinden van dubbelstrengs RNA structuren tijdens de replicatie. Het 60K eiwit wordt ook een functie toegedacht in het verankeren van CPMV RNA replicatiecomplexen aan de membranen waar de virale RNA synthese plaats vindt. VPg, tenslotte, wordt een rol toegedacht als primer in het starten van de RNA synthese (initiatie).Om meer te weten te komen over de functie van de verschillende door het B-RNA gecodeerde eiwitten bij de CPMV RNA replicatie werden de afzonderlijke B-eiwitten gesynthetiseerd in insektecellen door gebruik te maken van baculovirus expressievectoren (hoofdstukken 2 en 4). De 87K, 1 10K, 170K en 200K eiwitten, die allen het polymerase motief van het 87K eiwit bevatten, werden gemaakt om te bepalen welk van deze eiwitten het actieve RNA polymerase is, en om na te gaan of proteolytische klievingen van voorlopers van het 87K eiwit noodzakelijk zijn om een actief polymerase te verkrijgen.Na expressie in insektecellen werden CPMV eiwitten verkregen die, onder denaturerende condities, immunologisch niet te onderscheiden waren van de CPMV eiwitten die in CPMV-geïnfecteerde planten gevonden worden. Daarnaast vertoonden de uit insektecellen afkomstige eiwitten ook een aantal kenmerken van functioneel actieve CPMV eiwitten. Zo bleek dat eiwitten die het 24K protease domein bevatten, op juiste wijze gekliefd werden tot kleinere CPMV eiwitten. Daarnaast werd gevonden dat het 32K eiwit een regulerende rol had bij de klievingen van het 170K eiwit, hetgeen duidt op een correcte vouwing van de in insektecellen geproduceerde eiwitten. Met electronen- microcospie werd verder aangetoond dat in insectecellen waarin het 200K poly-eiwit gemaakt wordt structuren voorkomen die lijken op de zogenaamde cytopathologische structuren die in CPMV- geïnfecteerde cowpea cellen gevonden worden (hoofdstuk 4). Deze cytopathologische structuren bestaan uit ophopingen van membraanblaasjes, waarmee de virale RNA replicatie geassociëerd is, met daarnaast grote hoeveelheden electronendicht materiaal, waarvan de functie nog onbekend is maar waarin het merendeel van de B-RNA-gecodeerde eiwitten zijn samengepakt. De vesiculaire membranen worden ook gevonden in insektecellen waarin alleen het 60K eiwit geproduceerd wordt, hetgeen aangeeft dat het 60K eiwit betrokken is bij de vorming van deze structuren. In overeenstemming met de voorgestelde rol van het 60K eiwit als membraan-anker voor CPMV replicatiecomplexen, bleek bovendien dat het 60K eiwit in deze cellen gebonden aan de vesiculaire membranen voor komt. Tenslotte werd gevonden dat de vorming van de electronendichte structuren alleen dan plaats vindt wanneer, naast het 170K eiwit, ook het 32K eiwit in de insektecellen wordt geproduceerd.Hoewel de hierboven beschreven waarnemingen erop duiden dat de B-RNA-gecodeerde eiwitten verkregen uit insektecellen functioneel actief zijn, bleek het niet mogelijk om in extracten van insektecellen in vitro RNA polymerase activiteit voor deze eiwitten aan te tonen (hoofdstukken 3 en 4). Dit in tegenstelling tot de ook in insektecellen geproduceerde polymerases van de picornavirussen poliovirus en mond-en klauwzeer virus, die wel RNA kunnen synthetiseren op een toegevoegde poly(A)-bevattende RNA matrijs, mits die voorzien is van een oligo(U) primer. Het lijkt er dus op dat de polymerases van CPMV en van picornavirussen, ondanks homologie in aminozuur volgorde, beschikken over verschillende eigenschappen.Eén van de verklaringen voor de afwezigheid van polymerase activiteit voor de CPMV eiwitten zou kunnen zijn dat het CPMV polymerase een plant-specifieke component nodig heeft voor de RNA synthese. Om dit te onderzoeken werd een expressievector systeem gebruikt dat het mogelijk maakt om de verschillende door het B-RNA-gecodeerde eiwitten in cowpea protoplasten te synthetiseren (hoofdstuk 5). De in de protoplasten geproduceerde eiwitten bleken ook nu weer dezelfde eigenschappen vertoonden als die van de authentieke virale eiwitten. Door de expressie in cowpea protoplasten uit te voeren was het bovendien mogelijk om direct na te gaan of de virale eiwitten ook alle activiteiten bezaten die nodig zijn voor RNA replicatie. Hiertoe werden protoplasten geïnoculeerd met de verschillende expressievectoren, tesamen met M-RNA, dat voor replicatie afhankelijk is van de eiwitten van B-RNA. Replicatie van M-RNA bleek inderdaad plaats te vinden in protoplasten die getransfecteerd waren met de expressievector die codeerde voor het gehele 200K eiwit, maar niet in protoplasten waarin slechts een deel van dit 200K eiwit werd aangemaakt. Dit laat zien dat alle eiwitten van B-RNA noodzakelijk zijn voor de virale RNA replicatie. Hoewel het mogelijk was om polymerase activiteit in vivo aan te tonen, lukte het niet om deze replicase activiteit in vitro te reconstitueren. Ook in extracten van protoplasten was het CPMV polymerase niet in staat om toegevoegde RNA moleculen, al dan niet voorzien van een RNA primer, te gebruiken als matrijs voor RNA synthese. Het poliovirus polymerase, dat eveneens in cowpea protoplasten aangemaakt was, was wel tot deze activiteit in staat (hoofdstuk 5). Het lijkt er dus op dat het polymerase van CPMV, in tegenstelling tot het poliovirus polymerase, niet in staat is om toegevoegde RNA moleculen te herkennen als matrijs voor de RNA synthese.De experimenten die in hoofdstuk 6 beschreven zijn hadden tot doel die eigenschappen van de genomische RNAs van CPMV te vinden die verantwoordelijk zijn voor de herkenning van deze RNA moleculen door het virale replicase. Hiertoe werden cowpea protoplasten getransfecteerd met mutante B- en M-RNA moleculen en werd gekeken of deze RNAs gerepliceerd werden door de eiwitten afkomstig van normale (wild-type) B-RNA moleculen. Mutanten van B-RNA, die niet in staat zijn om zichzelf te vermenigvuldigen, werden ook niet gerepliceerd in aanwezigheid van het wild-type B-RNA. Hieruit blijkt dat de replicatie van B-RNA plaatsvindt in cis, wat wil zeggen dat de herkenning van een B-RNA molecuul als matrijs voor replicatie alleen plaats vindt door eiwitten die door vertaling van datzelfde B-RNA molecuul zijn gemaakt. Er lijkt dus sprake te zijn van een sterke koppeling van de translatie en de replicatie van het B-RNA. De replicatie van M-RNA is afhankelijk van de door B-RNA gecodeerde eiwitten en M-RNA wordt dus in trans gerepliceerd. Merkwaardig genoeg werd ook voor M-RNA gevonden dat er een koppeling was tussen translatie en replicatie. Replicatie van M-RNA moleculen vond alleen plaats indien translatie plaats vond van het 5'eind van het open leesraam, dat codeert voor het 58K eiwit. Dit wijst er op dat het 58K eiwit van M-RNA betrokken is bij de herkenning van datzelfde M-RNA molecuul als matrijs voor het B-RNA-gecodeerde replicatiecomplex. Deze waarneming houdt tevens in dat replicatie van een M-RNA molecuul alleen op kan treden indien initiatie van translatie plaats vindt op het eerste start codon, waarmee de synthese van het 105K poly- eiwit begint.Op grond van de in dit proefschrift beschreven resultaten is een nieuw model voor de RNA replicatie van CPMV opgesteld (hoofdstuk 7). In dit model wordt een verband gelegd tussen de translatie van de virale genomische RNAs, de proteolytische klieving van poly-eiwitten, de vorming van een replicatiecomplex aan een membraan en tenslotte de synthese van nieuwe RNA strengen, van zowel (+)- als (-)-polariteit. Het expressie systeem beschreven in hoofdstuk 6 biedt mogelijkheden verschillende onderdelen van dit model te toetsen, om aldus ons inzicht in het RNA replicatiemechanisme van CPMV en dat van nauw verwante RNA virussen nog verder te vergroten.</p