A bioreactor system was designed and installed for the large-scale micropropagation of Vanilla planifolia Jacks. an orchid of economic importance. The efficiency of the in vitro culture protocol using the conventional method in solid medium was compared with the temporary immersion system in liquid medium. The results showed that cultivation in bioreactors allowed to reach a higher rate of multiplication (12 shoots/explant) in 30 days of cultivation, while in the semisolid medium the rate of multiplication was lower (7 shoots/explant); this indicates that the cultivation system in bioreactors is an excellent alternative for in vitro propagation of this valuable species.Se diseñó e instaló un sistema de biorreactores para la micropropagación a gran escala de Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews, una orquídea de importancia económica. Se comparó la eficiencia del protocolo de cultivo in vitro empleando el método convencional en medio sólido con el sistema de inmersión temporal en medio líquido. Los resultados mostraron que el cultivo en biorreactores permitió alcanzar en 30 días de cultivo una tasa más elevada de multiplicación (12 brotes/explante) mientras que en medio semisólido la tasa de multiplicación fue menor (7 brotes/explante), indicando que el sistema de cultivo en biorreactores es una excelente alternativa para la propagación in vitro de esta valiosa especie

Iglesias-Andreu, L. G.

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Revista Agro Productividad

63AGROPRODUCTIVIDADESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE BIORREACTORES PARA LA MICROPROPAGACIÓN DE VAINILLA (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews)ESTABLISHMENT OF A BIOREACTOR SYSTEM FOR VANILLA (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews) MICROPROPAGACIÓN Jericó J. J.1, Bello-Bello, J. J.1, Spinoso-Castillo, J.1, Iglesias-Andreu, L. G.2*1Colegio de Postgraduados-Campus Córdoba. Carretera Federal Córdoba-Veracruz km 348, Con-gregación Manuel León, Municipio de Amatlán de los Reyes, C. P. 94946, Veracruz, México. 2Insti-tuto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana. Campus para la Cultura, las Artes y el Deporte, Xalapa, Veracruz México. *Autor responsable: xliglesias@gmail.comRESUMENSe diseñó e instaló un sistema de biorreactores para la micropropagación a gran escala de Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews, una orquídea de importancia económica. Se comparó la eficiencia del protocolo de cultivo in vitro empleando el método convencional en medio sólido con el sistema de inmersión temporal en medio líquido. Los resultados mos-traron que el cultivo en biorreactores permitió alcanzar en 30 días de cultivo una tasa más elevada de multiplicación (12 brotes/explante) mientras que en medio semisólido la tasa de multiplicación fue menor (7 brotes/explante), indicando que el sistema de cultivo en biorreactores es una excelente alternativa para la propagación in vitro de esta valiosa especie. Palabras clave: propagación, inmersión temporal, SIT, vainillina.ABSTRACTA bioreactor system was designed and installed for the large-scale micropropagation of Vanilla planifolia Jacks. an orchid of economic importance. The efficiency of the  in vitro culture protocol using the conventional method in  solid medium was compared with the temporary immersion system in liquid medium. The results showed that cultivation in bioreactors allowed to reach a higher rate of multiplication (12 shoots/explant) in 30 days of cultivation, while in the semisolid medium the rate of multiplication was lower (7 shoots/explant); this indicates that the cultivation system in bioreactors is an excellent alternative for in vitro propagation of this valuable species.Key words: propagation, temporary immersion, SIT, vanilla.64 AGROPRODUCTIVIDADMicropropagación de vainillaINTRODUCCIÓNLa vainilla (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews) es una or-quídea que se cultiva comercialmente por sus silicuas aromáticas de las cuales se extrae la vainillina, una sustancia sabori-zante ampliamente demandada para su uso en la industria alimenticia y como cosmético (Bory, 2008). A pesar de su importancia esta especie se encuentra amenazada (NOM-ECOL-059-2001) debido a que las poblaciones silvestres han sido diezmadas con la recolecta excesiva para establecer plantaciones comerciales. En México es una especie subutilizada, ya que actualmente sólo se produce cerca de 1% de la producción mundial y no se ha aprovecha la denominación de origen “Vainilla de Papantla” que el Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial (IMPI) le otorgó en 2009 para su protección (Soto, 2006). Una de las limitantes actuales de esta especie es que no se cuenta con protocolos eficientes para su propagación masiva. En la actualidad esta especie se propaga comercialmente por la vía asexual mediante el uso de esquejes (segmentos de tallo) que se obtienen de plantaciones comerciales, sin embargo, dada la importancia económica, social y cultural del cultivo, así como el desabasto de propágulos resulta importante contar con un protoco-lo eficiente para propagar comercialmente la especie (Figura 1). La micropropagación de plantasLa micropropagación o clonación in vitro de plantas es una de las aplicacio-nes biotecnológicas más desarrollada en los últimos años. En la actualidad constituye una de las herramientas más utilizadas. Por esta vía, es posible obtener un gran número de individuos libres de plagas y enfermedades en menor tiempo y empleando espacios reducidos. Actualmente la industria biotecnológica agrícola en México cuenta con potencial productivo para la propagación masiva de plantas. Sin embargo, el empleo de la micropropaga-ción a escala comercial se ha limitado cada vez más, debido principalmente a los altos costos por mano de obra, baja eficiencia biológica y falta de au-tomatización durante los procesos de la micropropagación. Existen reportes para micropropagación de V. planifolia (Philip y Nainar, 1986; Tencio, 1992; Lee-Espinosa et al., 2008; Minoo 2009; Palama et al., 2010; Chin Tan et al., 2011). Sin embargo, los protocolos de micropropagación que se han desa-rrollado en este cultivo tienen baja tasa de multiplicación; además, el uso de sistemas de inmersión temporal no ha sido reportado en esta especie.Sistemas de inmersión temporal (SIT)El Sistema de Inmersión Temporal (SIT) es el cultivo de células, tejidos u ór-ganos expuestos temporalmente a medio de cultivo líquido en biorreactores semiautomatizados bajo condiciones axénicas y controladas. Actualmente existen una amplia gama de modelos y sistemas automatizados que se em-plean en la micropropagación de plantas, dentro de los cuales destaca el Bio-rreactor de Inmersión Temporal (BIT®) (Escalona et al., 1999), el Recipiente de Inmersión Temporal Automatizado (RITA®) (Alvard et al., 1993), el Biorreactor Modular de Inmersión Temporal (BioMINT®) (Robert et al., 2006), el Plan-tima® (A-Tech Bioscientific, 2010) y, más recientemente, el SETIS® (SETIS, 2012). La tecnología de biorreactores y técnicas de micropropagación de alta frecuencia abren las puertas para lograr un mayor escalado en el proceso de micropropagación. El sistema de micropropagación que se propone en el Figura 1. Huerta comercial de vainilla (Vanilla planifolia) originada asexual-mente. Esqueje y yema.65AGROPRODUCTIVIDADMicropropagación de vainillapresente trabajo permite la semiau-tomatización del proceso y evita el uso de agentes gelificantes que en-carece el proceso convencional, re-duce los costos ocasionados por la mano de obra y aumenta la eficien-cia biológica del cultivo in vitro de V. planifolia. Con base en lo anterior, el objetivo del presente fue desarrollar un protocolo para la micropropaga-ción eficiente del germoplasma de V. planifolia.MATERIALES Y MÉTODOSEl presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo Vegetal del Instituto de Biotecnología y Eco-logía aplicada (INBIOTECA) de la Universidad Veracruzana. Para su ejecución primeramente se diseñó e instaló el SIT a nivel de laborato-rio y posteriormente se estableció el protocolo de micropropagación. Para la instalación del SIT se adecuó un espacio físico con control de las condiciones de temperatura y hu-medad adecuadas para el desarrollo e incubación de los cultivos in vitro. Se dispuso de un anaquel cuya par-te superior se adaptó para ubicar un recipiente con los explantes y, en su parte inferior, otro conteniendo el medio de cultivo. Ambos frascos estuvieron comunicados a través de mangueras de silicona. Las condi-ciones de esterilidad se lograron mediante el empleo de filtros hidrofóbicos de 0.2 m. Según el tiempo programado, la válvula y el aire proveniente del compresor se abren para impulsar el medio de cultivo hacia la parte superior conteniendo los explantes. Durante el período de inmersión se produce un flujo de aire que genera el burbujeo del medio que a su vez remueve los explantes. Pasado el tiempo de inmersión, el líquido regresa por gravedad al reservorio de medio de cultivo. La frecuencia y el tiempo de inmersión se regulan mediante el empleo de un temporizador o controlador lógico programable (PCL). De esta forma se logra la automatización del sistema de inmersión temporal (Figura 2). Propagación in vitro  Se emplearon como explantes, yemas y ápices de plantas de vainilla (V. plani-folia) recolectadas en Papantla, Veracruz México; se lavaron bajo un flujo de agua corriente por 45 minutos. Posteriormente se mantuvieron en agitación por 30 minutos en una solución de Benomilo 1 g L1 (Promyl®). Una vez en la cámara de flujo laminar se procedió a desinfectar los explantes en solucio-nes de etanol al 70% v/v durante 30 s y cloro comercial al 10% v/v durante 20 minutos. Finalmente se aplicaron tres enjuagues con agua destilada estéril. Después de este tratamiento los explantes se sumergieron nuevamente por 10 minutos en una solución al 3% de cloro comercial (hipoclorito de sodio) y se enjuagaron en tres ocasiones con agua destilada estéril. Los explantes se cultivaron en medio de multiplicación MS (Murashige y Skoog, 1962) suple-mentado con 2 gL1 de benciladenina (BA) de acuerdo con la metodología propuesta por Lee-Espinoza et al. (2008). Para la etapa de enraizamiento se utilizó medio MS al 50% sin reguladores del crecimiento. Para el medio semi-sólido se usó Gelrite™ (SIGMA®) al 0.22% (w/v) como agente gelificante. El pH de los medios fue ajustado a 5.8. La esterilización se realizó en autoclave a 1.5 Kg cm2 de presión y 121 °C durante 20 minutos. Los recipientes de cul-tivo, conteniendo tres explantes para el medio semisólido y cinco para el SIT, fueron incubados a 242 °C y se mantuvieron bajo luz fluorescente (40-50 mol m2 s1) con fotoperiodo de 16:8 h luz/oscuridad. Se utilizó un diseño Figura 2. Diagrama del sistema de inmersión temporal (SIT). A: Sin inmersión. B: Con inmersión. 1: Compre-sor de aire, 2: Manguera de silicón, 3: Temporizador, 4: Bomba de solenoide, 5: Conexión a tubo de venteo, 6: Filtro venteo, 7-8: Recipiente con explantes.66 AGROPRODUCTIVIDADMicropropagación de vainillaexperimental completamente al azar y se emplearon 30 explantes por tratamiento. Los datos fueron analizados mediante el paquete estadístico SPSS v. 11.5 para Win-dows y, para detectar diferencias entre los tratamientos, se realizó una prueba t-Student (p0.05).RESULTADOS Y DISCUSIÓNLos resultados obtenidos mostraron que fue posible lograr la inducción de brotes en los dos sistemas eva-luados. Sin embargo, el cultivo en biorreactores resultó ser el más eficiente ya que permitió obtener 12 brotes por explante en promedio. El cultivo en medio semisó-lido solo permitió obtener una tasa de multiplicación de siete brotes por explante (Cuadro 1). El sistema de inmersión temporal en biorreactores aumentó en 42% la tasa de multiplicación, comparado con el sistema en medio sólido. La longitud de los brotes fue mayor en medio sólido (1.8 cm), mientras que en inmersión temporal fueron de 1.4 cm en promedio. Esto se debió probablemente a que los formados en inmersión temporal tienen mayor superficie de contacto con el medio de cultivo líquido. Además, los formados en medio líquido fueron homo-géneos. Una de las ventajas del sistema de inmersión temporal, comparado con otros realizados in vitro, es que permite combinar la aireación con la inmersión del explante, sometiéndolo al tiempo y periodo de inmer-sión requerido para que las plántulas tomen del medio de cultivo los nutrientes y reguladores del crecimien-to para su desarrollo. Esta es una de las razones que lo hacen más eficiente. De acuerdo con Alvard et al. (1993), el tiempo de inmersión del explante es, proba-blemente, la característica que más atención requiere cuando se desea propagar una especie. Los SIT han sido empleados para la micropropagación de plantas de cítricos (Citrus spp.) (Cabasson et al., 1997), caña de azúcar (Saccharum officinarum) (Lorenzo et al., 1998), cafeto (Coffea arabica) (Etienne-Barry et al., 1999), ba-nano (Musa paradisica) (Colmenares y Giménez, 2003), manzano (Malus domestica) (Zhu et al., 2005), eucalip-to (Eucaliptus spp.) (McAlister et al., 2005), chile haba-nero (Capsicum chinense) (Bello-Bello et al., 2010), en-tre otros. En el caso particular de V. planifolia, los brotes obtenidos bajo el SIT mostraron ser más vigorosos en comparación con aquellos que fueron cultivados en medios semisólido (Figura 3).Cuando los brotes alcanzaron entre 2-4 cm de longitud después de 30 días de cultivo in vitro, fueron trasferidos a etapa de enraizamiento en biorreactores, donde 100% de los brotes produjeron raíces (Figura 4 A), con 95% de supervivencia durante la etapa de aclimatización, obser-vándose plántulas vigorosas (Figura 4 B).CONCLUSIONESEl sistema de micropropagación de vainilla emplean-do los biorreactores propuestos aumentan la tasa de multiplicación y permiten disminuir el costo de ope-ración y el uso de agentes gelificantes, facilitando la Cuadro 1. Número y longitud de brotes de vainilla (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews) desarrollados en diferentes sistemas de cultivo in vitro.Sistema de cultivo Número de brotes/explante (mediaES)Longitud(cm)Medio sólido   7.110.31 b 1.880.09 aInmersión temporal 12.040.48 a 1.450.07 b*Los valores representan la mediaES (error estándar). Medias con diferente letra entre columnas son significativamente diferentes (t-Student, p0.05).Figura 3. Desarrollo de brotes obtenidos en diferentes sistemas de micropropaga-ción. A: Medio semisólido. B: Inmersión temporal.AB67AGROPRODUCTIVIDADMicropropagación de vainillaregeneración de plantas a gran escala, lo que hace posible liberar accesiones conservadas in vitro y facilitar su reinserción a los ecosis-temas alterados.LITERATURA CITADAAlvard D.C., Teisson C.D. 1993. Comparison of methods of liquid medium culture for banana micropropagation. Effects of temporary immersion of explants. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 32: 55–60. A-Tech Bioscientific (http://www.atechbios.com.tw)Bello-Bello J., Canto-Flick A., Balam-Uc E., Gómez-Uc E., Robert M., Iglesias-Andreu L., Santana-Buzzy N. 2010. Improvement of In Vitro proliferation and Elongation of Habanero Pepper Shoots (Capsicum chinense Jacq.) by Temporary Immersion. HORTSCIENCE 45(7): 1093–1098.Bory S., Lubinsky P., Risterucci A.M., Noyer J.L., Grisoni M., Duval M.F., Besse P. 2008. Patterns of introduction and diversification of Vanilla planifolia (Orchidaceae) in Reunion Island (Indian Ocean). Am. J. Bot. 95 (7): 805-815Cabasson C., Alvard D., Dambier D., Ollitrault P., Teisson C. 1997. Improvement of Citrus somatic embryo development by temporary immersion. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 50: 33–37Chin T.B., Foan C., Alderson P. 2011. Optimization of plantlet regeneration from leaf and nodal derived callus of Vanilla planifolia Andrews. Plant Cell. Tiss Org. Cult. 105: 457–463.Colmenares M., Giménez C. 2003. 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ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE BIORREACTORES PARA LA MICROPROPAGACIÓN DE VAINILLA (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews)

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