L’étude de la glycoprotéine gM du virus Herpès simplex de type 1 (HSV-l) : identification de ses partenaires viraux et cellulaires et leur rôle dans la régulation de l’infection virale

Abstract

Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-l) est l’agent pathogène qui cause l’herpès labial souvent appelé feu sauvage. Le virus se compose d’un génome viral d’ADN protégé dans une capside icosaédrique entourée d’une couche protéique appelé le tégument. La structure du virion est enfermée dans une enveloppe lipidique riche en glycoprotéines virales. La glycoprotéine M (gM/UL10) du virus HSV-1 est considérée comme étant non essentielle pour le virus, mais est qui est toutefois conservée dans la famille Herpesviridae. Durant le cycle de réplication du virus HSV-1, gM est exprimée très tôt, mais également lors des évènements tardifs du cycle viral. Elle a la particularité de se localiser dans différents compartiments membranaires, et semble jouer un rôle important dans la modulation de la fusion induite par le virus. Cette régulation impliquerait des interactions de gM avec d’autres protéines virales et cellulaires, ce qui nous amène à l'objectif de ce projet, soit l’identification et la caractérisation des partenaires viraux et cellulaires de gM et leur rôle dans la régulation de l’infection virale. Le premier article présenté dans cette thèse et qui a été publié dans Journal of Virology s'attarde sur le complexe gM/gN du virus HSV-1, complexe qui a été documenté pour d’autres virus herpétiques mais pas HSV-1. Lors de cette étude, nous avons examiné l'interaction putative de gM/gN. Nous avons confirmé que les deux protéines forment un complexe et que gM redirige gN du réticulum endoplasmique (RE) au TGN. Nous avons observé que la surexpression de la glycoprotéine gN stimule la formation de syncytiums dans le contexte d'une infection par une souche non syncytiale, indiquant que gM et gN interagissent non seulement physiquement, mais aussi fonctionnellement à la modulation de la fusion membranaire. Ces résultats nous ont aidés à mieux comprendre le rôle que joue le complexe gM/gN dans le mécanisme de fusion virale. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons cherché à identifier des partenaires cellulaires potentiels de gM. En utilisant une approche d'immunoprécipitation (IP) couplée à la spectrométrie de masse (MS / MS), nous avons identifié la protéine cellulaire E-Syt1 (Extended synaptotagmin-1) comme partenaire de gM. Cette interaction a été confirmée par co-immunoprécipitation dans des cellules transfectées et également dans un contexte d’infection. De plus, l'utilisation d’ARN d’interférences ciblant spécifiquement E-Syt 1et/ou E-Syt3, nous a permis de démontrer que ces protéines régulent négativement l’entrée du virus, sa sortie ainsi que sa propagation cellule à cellule. Il devient alors clair que gM interagit avec différentes protéines à la fois virales et cellulaires durant le cycle viral. Le changement dans les niveaux d'expression de ces protéines perturbe l'infection par le virus HSV-1 et met en évidence l’interaction entre la machinerie de fusion cellulaire et virale.Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is an important human pathogen that causes a variety of diseases ranging from mild skin disorders to fatal encephalitis. HSV-1 virions are constituted of an icosahedral DNA-containing capsid that is surrounded by a lipid envelope. The surface of the viral envelope is decorated with an array of glycoprotein spikes. Glycoprotein M, (gM) encoded by UL10, is considered as a non-essential glycoprotein, however is highly conserved throughout the herpesvirus family. In the course of infection, gM is expressed at both early late stages of the viral life cycle. This protein can localize in different membranous compartments, and is able to modulate virus-induced membrane fusion. This property, most certainly implies the interaction of gM with other viral and cellular proteins. Therefore, it prompted us to identify and characterize gM viral and cellular interacting partners and its regulatory functions during viral infection. The first article presented in this thesis has been published in Journal of Virology and focuses on HSV-1 gM/gN complex, which has been documented in several herpesviruses but this has not yet been demonstrated for HSV-1. As a part of this study, we examined the putative interaction of gM / gN. We confirmed that gM and gN complex and their interaction is sufficient for gN to transport from the ER to the TGN. Furthermore, we showed that the overexpression of gN during the infection stimulates the formation of syncytia indicating that gM and gN not only interact physically but also functionally. This suggests a role of gN in membrane fusion. These results contributed to a better understanding of the role of gM/gN complex as a new fusion modulator in viral fusion. In the second article presented in this thesis, we set out to identify potential cellular partners of gM, using an immunoprecipitation (IP) assay combined with mass spectrometry (MS/MS). We identified the Extended synaptotagmin-1 (E-Syt1) as a gM interacting partner. Next, this interaction was confirmed by co-immunoprecipitation in transfected cells and also in the context of infection. Moreover, by using small interfering RNAs (siRNA) specifically targeting E-Syt1 and/or E-Syt3, we were able to show that these proteins negatively regulate the entry, egress and the cell-to-cell spread of the virus. Manipulating the expression of E-Syt 1 and /or E-Syt3 disrupts HSV-1 replication and demonstrates the interaction between cellular and viral fusion machinery