Zusammenfassung
COPI-Vesikel sind für den retrograden Transport von Proteinen und Lipiden vom
Golgi-Apparat zurück zum ER und für den bidirektionalen Transport innerhalb des
Golgi-Apparates verantwortlich. Die kleine GTPase Arf1 und der heptamere
Proteinkomplex Coatomer sind wesentliche Bestandteile der Proteinhülle.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Lokalisation von Arf1 innerhalb der COPI-Hülle
und die Interaktion mit Coatomer näher analysiert. Hierzu wurde ein System
verwendet, welches es ermöglicht, die photolabile Aminosäure p-Benzoyl-Lphenylalanin
(Bp) an eine definierte Stelle innerhalb eines Proteins einzubauen. Es
wurden Arf1-Derivate generiert, bei welchen an zwei unterschiedlichen Stellen
jeweils ein Bp eingebaut wurde. Diese Proteine wurden an Golgi-Membranen und an
synthetisch hergestellte Liposomen rekrutiert und nach der Zugabe von Coatomer
wurde das Bp durch Bestrahlung mit UV-Licht aktiviert. Somit wurde Arf1 kovalent mit
möglichen Bindungspartnern, die sich in einer Umgebung von 3 Å befinden,
verknüpft. Arf1 I46Bp Y167Bp zeigte eine gleichzeitige GTP-abhängige Interaktion
mit den beiden Coatomer-Untereinheiten β- und δ-COP. Die genaue
Interaktionsstelle innerhalb von Coatomer konnte nicht ermittelt werden. Anhand von
strukturellen Homologien zu dem Clathrin Adaptor-Komplex AP-2 jedoch wird
vermutet, dass Arf1 an β- und δ-COP, die aus dem gleichen Coatomer-Komplex
stammen, bindet.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Arf1 I49Bp E98Bp nicht nur, wie bereits
bekannt war, über die switch I Region (I49) mit γ-COP interagiert, sondern dass auch
die „Rückseite“ (E98Bp) von Arf1 eine Bindung mit β-COP eingeht. In diesem Fall
handelt es sich um Untereinheiten aus zwei verschiedenen Coatomer-Komplexen, da
die Proteine innerhalb eines Komplexes einen zu großen Abstand zueinander
aufweisen, als dass Arf1 mit beiden gleichzeitig interagieren kann. Es konnte somit
zum ersten Mal gezeigt werden, dass Arf1 zwei unterschiedliche Coatomer-
Komplexe über die Untereinheiten γ- und β-COP miteinander verbrücken kann.
Neben den Untersuchungen zur Interaktion von Arf1 mit Coatomer wurde im Rahmen
dieser Arbeit Chaetomium Arf1 kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Dieses
thermostabile Protein zeigte in verschiedenen Funktionalitätstests die gleiche
Aktivität wie humanes Arf1. Somit kann es für weitere Untersuchungen, wie
beispielsweise Ansätze zur Kristallisation von Volllängen-Arf1 im Komplex mit
Coatomer eingesetzt werden
