Die retrovirale Gentherapie wurde bereits in mehreren klinischen Studien erfolgreich zur Behandlung monogenetischer Erkrankungen eingesetzt. Die vektorassoziierte Aktivierung zellulärer Protoonkogene (z.B. MDS1/EVI1) und die Manifestation maligner Transformation in einzelnen Patienten verdeutlichten jedoch das Risiko, das mit dem Einsatz integrierender Vektorsysteme verbunden ist. Neben der Protoonkogen-Aktivierung existieren noch weitere vektorassoziierte Ereignisse mit potentiell toxischen Auswirkungen (z.B. Haploinsuffizienz, Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen, aberrante Transkripte und veränderte Proteine). Ein genaues Verständnis der unterschiedlichen Aspekte der Genotoxizität gentherapeutischer retroviraler Vektoren ist daher von größter Wichtigkeit für deren klinische Anwendung.
In dieser Arbeit wurden sicherheitsrelevante Parameter der Funktion SIN-retroviraler Vektoren für die Gentherapie der Septischen Granulomatose (X-CGD) systematisch quantifiziert. Vergleichende Integromanalysen wurden verwendet, um ein Aktivitätsprofil genetischer Nebenwirkungen in vitro und im präklinischen Mausmodell zu erheben. Die Vektoren verursachten keine vektorvermittelte klonale Selektion und wiesen eine signifikant geringere Inzidenz von Integraten im MDS1/EVI1 Lokus auf als die herkömmlichen Vektoren mit vollständigen ‚Long Terminal Repeats‘ (LTR). Die Untersuchung viral-zellulärer Spleißprodukte mit einem gammaretroviralen SIN-Vektor zeigte nur vereinzelte aberrante Fusionstranskripte.
Klonalitätsanalysen der frühen Hämatopoese nach klinischer SIN-lentiviraler Gentherapie (University College London) zeigten eine polyklonale genkorrigierte Repopulation, wobei die unzureichende Konditionierung des Patienten nach 6 Monaten zum Verlust der Genmarkierung führte. Im Gegensatz zu bisherigen X-CGD Gentherapiestudien fand hier keine bevorzugte Integration in den Genlokus MDS1/EVI1 statt. Somit konnte gezeigt werden, dass der genetische Hintergrund der X-CGD keinen offensichtlichen Einfluss auf die präferentielle Integration in diesen Lokus oder andere ausübt.
In primären hämatopoetischen Zellen und in einem Genotoxizitätsassay mit einer IL-3 abhängigen Zelllinie wurden die Auswirkungen verschiedener lentiviraler Vektoren untersucht. Die Art und Aktivität des internen Promotors in SIN-lentiviralen Vektoren bestimmt maßgeblich das Integrationsprofil sowie die Bildung chimärer Transkripte. Es wurde gezeigt, dass der interne Promotor die Restaktivität des 5’-SIN-LTRs und somit das Risiko zur Bildung viral-zellulärer Fusionstranskripte unter Beteiligung des kanonischen Spleißdonors erhöht. Mit einem schwachen Promotor sinkt hingegen die Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung aberranter Transkripte. Durch den Genotoxizitätsassay wurde die Bedeutung der Inzidenz viral-zellulärer Fusionstranskripte für das genotoxische Potential lentiviraler Vektoren bestätigt.
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass durch hochauflösende funktionelle Integromanalysen eine fundierte Einschätzung der biologischen Sicherheit gentherapeutischer retroviraler Vektoren möglich ist. Der Einfluss neuer struktureller Vektorelemente auf das Sicherheitsprofil wurde definiert und dessen biologische Relevanz anhand der generierten Transkripte und in angeschlossenen Genotoxizitätsassays bestimmt. Detaillierte präklinische Analysen gammaretro- und lentiviraler SIN-Vektoren ermöglichten den Nachweis der sicheren und effizienten retroviralen X-CGD Gentherapie und deren Translation in die Klinik. Ein sicherheitsoptimierter SIN-gammaretroviraler Vektor wurde für eine klinische Phase I/II X-CGD Studie zugelassen
