Evaluación de la actividad quitinolítica y quitin-desacetilasa de extractos enzimáticos producidos por fermentación sólida a partir de cutícula de camarón.

Abstract

Los hongos entomopatógenos son un grupo de microorganismos que revisten gran importancia en el manejo de plagas dentro de los agroecosistemas, son reconocidos como agentes de control biológico por su capacidad natural de producir diferentes compuestos que causan enfermedad y muerte a los insectos (Assaf, 2007; Dias, et. al., 2008; Mustafa y Kaur, 2009). Existen más de 700 especies de hongos asociados a insectos, algunos de los cuales se utilizan como productos de control biológico, por ser fáciles de manipular, multiplicar, ser efectivos en el control de plagas de importancia agrícola y ser inocuos para otras especies y el ser humano (France, 2000) y dentro de sus ventajas se pueden mencionar que: poseen mecanismos de invasión que les permiten atravesar la cutícula o la pared del tracto digestivo de los insectos, actuando como insecticidas de contacto y no necesitan ser ingerido (Charnley y Collins, 2007). Su aplicación y manejo no representa peligro para el hombre y son inocuos en los productos agrícolas (Leng, et al. La quitina es el polímero más abundante después de la celulosa. Está presente en la pared celular de hongos, levaduras y en el exoesqueleto de los invertebrados como cangrejos e insectos (Rodríguez y Ramírez, 2012). Es un polisacárido natural, de tonalidad blanca-amarillenta, rígido y no elástico. Se calcula que su tasa de regeneración en la biosfera es de casi el doble de la celulosa. La principal fuente de obtención de la quitina son los desechos de los crustáceos (Pacheco, 2013). Este polímero es biodegradable debido a la presencia de las enzimas llamadas quitinasas, ampliamente distribuidas en la naturaleza y encontradas en bacterias, hongos, plantas y en el sistema digestivo de varios animales. Las quitinasas están involucradas en la defensa contra invasión de bacterias. La quitina desacetilasa es una hidrolasa perteneciente a la familia 4 de las carbohidrato-esterasas (CE4) y cataliza la conversión de quitina en quitosana, mediante la desacetilación de los residuos de NAG presentes en la molécula de la primera. La quitin desaetilasa puede desacetilar oligosacárido solubles, producidos por acción de endoquitinasas sobre la quitina, fenómeno que puede darse durante la autolisis de la pared celular de aquellos microorganismos con quitina en dicha estructura. En estudios más recientes se ha demostrado que las quitin desacetilasas en general son más activas sobre oligosacáridos formados por NAG. Dentro de los procesos de fermentación en medio sólido se puede encontrar la participan de microorganismos que requieren oxígeno a partir de un cultivo aireado, siendo un parámetro fundamental para el desarrollo del proceso (Pandey 2000, 2003. En tanto que los para la identificación y cuantificación de los productos de las reacciones enzimáticas se requieren de métodos espectrofotométricos y/o cromatográficos como es el caso de la Cromatografía de Gases, en donde esta 38 herramienta analítica es la técnica de más amplia utilización para el análisis de compuestos volátiles. La utilización de la cromatografía de gases está restringida a la separación de compuestos con un peso molecular menos de 1000 a una temperatura máxima de trabajo de aproximadamente 400 °C; dentro de estos límites la única limitación existente será la estabilidad térmica. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad quitinolítica y quitin-desacetilasa de extractos enzimáticos producidos por fermentación sólida, a partir de cutícula de camarón, empleando los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Lecanicillium lecanii y Trichoderma harzianum. Para cumplir con este objetivo se llevaron a cabo fermentaciones en medio sólido empleando caparazón de camarón como fuente de carbono por su contenido de quitina. Las fermentaciones se llevaron a cabo bajo condiciones simuladas de aireación y sin aireación con la finalidad de determinar el efecto de este parámetro sobre las variables importantes del cultivo, especialmente sobre la inducción de las actividades N-acetilglucosaminidasa y Quitindesacetilasa. Se pudo comprobar que la aireación sí juega un papel importante en los parámetros del crecimiento, los parámetros de la fermentación y las actividades enzimáticas de los microorganismos y en especial de los hongos entomopatógenos estudiados en este trabajo, los cuales se vieron favorecidos bajo estas condiciones de cultivo. En este sentido, todos los hongos fueron capaces de crecer empleando caparazón de camarón como fuente de quitina, lo cual lo hace un residuo muy interesante para seguir empleando como modelo de estudio. Los extractos enzimáticos de los cultivos en medio sólido de Lecanicillium lecanii y Metarhizium anisopliae presentaron los mayores títulos de actividad N-acetilglucosaminisada, con valores de 444.22±0.02 y 252.77±0.0052 U/gms a las 60 y 72 h, respectivamente. En el caso de la actividad Quitindesacetilasa, los mejores productores fueron Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, con títulos de 8.09±0.001 y 18.65±0.001 U/gms a las 34 y 72 h, respectivamente. Es importante resaltar que en el caso de los extractos obtenidos de L. lecanii sin aireación, los títulos de actividad N-acetilglucosaminidasa se mantuvieron estables por aproximadamente 60 h (sin diferencia significativa entre estos tiempos de producción enzimática), lo cual es importante porque permite obtener estas enzimas en tiempos más cortos en comparación con otros microorganismos. Los títulos de actividad enzimática obtenidos en ese trabajo son explicados por el uso de soportes que favorecen la producción de las enzimas, como el residuo de camarón que contiene quitina, ya que se ha descrito que Metarhizium anisopliae requiere de la acción de QDAs (Murad et al., 2008) al igual que los demás microorganismos estudiados para actuar sobre estos sustratos. 39 Para poder establecer las condiciones de operación del cromatógrafo de gases para la cuantificación de los productos de reacción enzimática de los extractos crudos provenientes de las fermentaciones de los HE, se manejó un Cromatógrafo de Gases VARIAN CP-338, con detector FID. Sin embargo, ya no fue posible analizar las muestras y sólo se determinaron algunas condiciones de operación. Se recomienda llevar a cabo las fermentaciones de estos microorganismos con niveles de aireación controlados de tal manera que se permita mejorar las actividades obtenidas en este estudio