博士論文 (Doctoral dissertation)doctoral thesi

410463

張, 国全

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氏 名(本籍)学 位 の 種 類学 位 記 番 号学位授与年月 日学位授与の要件研究科及 び専攻研究指導を受けた大学学 位 論 文 題 目蕃 査 委 員張 国 全 (中華人民共和国)博士(獣医学)獣医博甲第53号平成10年3月13日学位規則第4条第1項該当連合獣医学研究科獣医学専攻岐阜大学Some Characteristics of comL Gene Encodinga27-kDa OuterIembrane Protein ofbumedi&ndlolecular EpidetLiology of Q Fever主査 岐 阜 大 学 教 授 平 井 克 哉副査 帯広畜産大学 教 授 品 川 森 一副査 岩 手 大 学 教 授 品 川 邦 汎副査 東京よ工大学 数 接 木 多 英一副査 岐 阜 大 学 教 授 源 宣 之論 文 の 内 容 の 要 旨Cα扇dね山川e班は人獣共通の病原体で世界各国に広く分布している｡宿主域は家畜､愛玩動物､野生動物および鳥類など極めて広い｡感染動物はほとんど症状を示さないが､ヒトの本症は急性呼吸器疾患､肝炎および心内膜炎などを呈し､欧米では古くから重要な疾患として関心が高い｡著者の属する研究室ではこれまでに､血清学的および病原学的研究から､日本にもC.血me班がヒトおよび動物に広く侵淫していることを明らかにしてきた｡しかし､日本分離C.血me班株の分子生物学的性状およびヒトQ熱の分子疫学については十分理解されていない｡著者は､本研究において､急性および慢性例由来株の27-k払外膜蛋白質の遺伝的および抗原的性状を解析し､得られた情報により､Q熱の診断および疫学調査に有用な方法を開発した｡さらに､日本のヒトQ熱の分子疫学についても検討した｡C.わumedjの国外分離11株(急性例由来5株､慢性例由来5株およびヤギ流産胎仔由来1株)および国内分離10株(ウシ由来5株､ダニ由来3株､ウシ流産胎仔由来1株およびヒト急性例由来1株)計21株の∝∬正造伝子の塩基配列を決定した｡21株の塩基配列を比較解析した結果､C00正遺伝子の塩基および推定アミノ酸配列は株間で相同性が極めて高いが､慢性例由来株に特異的な塩基およびアミノ酸残基がみられた｡C.b肌e班の21株はc00扉遺伝子の特異的な塩基および推定アミノ酸により4群に分けらー182-れた｡国外急性例由来4株と国内ダニ､生乳および急性例由来10株は1群に､国外慢性例由来の2および3株はそれぞれ2および3群に､国外急性例由来1株およびヤギ流産胎仔由来1株は4群に属した｡以上のように､ウシ､ダニおよびヒト急性および慢性例由来株は､塩基配列で異なり､C.加me班株の鑑別に有用であることが示唆された｡C.bumetiLの27-kDa外膜蛋白質のアミノ酸残基がどのような抗原決定基をコードするを明確にするため､急性および慢性例由来計8株からのcomJ遺伝子を発現ベクターPET21cにクロニングし､大腸菌に発現させた｡SDS-PACEおよび血munoblotbg法により､8株の組換え体はすべて分子量約32および30KDaの蛋白質を発現していることが確認された｡発現蛋白質はC.bumeELj免疫血清および27-kDa外膜蛋白質を認識するモノクロナール抗体とすべて反応することから､少数のアミノ酸の相異にもかかわらず､8株の27-kIね外膜蛋白質には共通な抗原決定基が存在することが判った｡一方､精製した27-kIね発現蛋白質はELISA抗原として有用であることをQ熱ヒト血清を用いて評価した｡すなわち､発現蛋白質およびNineMneII相菌を抗原として用い比較したところ､IF陽性の40検体は全例が陽性で､IF陰性の20検体は全例が陰性であった｡この結果から､27-kDa発現抗原を用いたELISA法は､特異性が高く､抗体検出に有用であることが示唆された｡C00扉遺伝子の塩基配列からプライマーを設計し､新しい遺伝子診断法を開発した｡設計したNestedPCR用プライマーの特異性はC.bumetij21株および他の微生物を用いて確認された｡すなわち､C.bumetii21株からは標的の438bpDNA断片が増幅され､他の微生物からは増幅されなかった｡また､増幅産物は制限酵素ふ〆および5誠により切断され､α)m上達伝子特異的な塩基配列であることが確認された｡さらに､開発したNested PCR法はC.bumedLの検出に有用であることをヒトQ熱血清を用いて評価した｡すなわち､IF陽性155血清中135例から､また､IF陰性100血清中10例から､∝∬漬遺伝子断片が増幅された｡以上の結果から､∝肝止遺伝子を標的とするNested PCR法は､特異性が高く､C.bumedj の検出に有用であることが示唆された｡C.血MⅥe班プラスミドの検出は､Q熱患者からの81血清を用いて､QpHlおよびQpRSプラスミドのそれぞれに特異的な辻伝子からプライマーを設計しNested PCRによって行った｡QpHlプラスミド特異的な塩基配列は81検体中40例(49.4%)から検出され､また伽RSプラスミド特異的な塩基配列は39例(29.6%)から検出された｡また､5検体(8.6%)からは伽Hlおよび①RSプラスミド特異的な塩基配列が同時に検出された｡12検体(20.7%)からは伽Hlおよび伽RSプラスミド特異的な塩基配列が検出されなかった｡以上の結果から､異なるプラスミドを保有するC.玩椚把班 が日本にも侵淫していることが示唆された｡また､患者血清からQpRSプラスミドを保有するC.血MⅥe班 が検出されたことは､慢性Q熱患者が日本にも広く存在することを示唆している｡伽Hlおよび①RSプラスミドが同時に検出されたことは､これまでに報告がなく､QpHlおよびQpRSプラスミド保有株の混合感染､あるいは2種類のプラスミドを保有する株による感染の可能性が考えられた｡-183-著者は､本論文において､COmJ遺伝子の塩基および推定アミノ酸配列は株間で相同性が極めて高いこと､および慢性例由来株に特異的な塩基およびアミノ酸残基が存在することを初めに明らかにした｡また､異なる株の27一足ね外膜蛋白質に共通な抗原決定基が存在すること､および27-kDa発現蛋白質はELISA抗原として抗体検出に有用であることを明らかにした｡さらに､∝肥沃遺伝子塩基配列の情報により､新しい遺伝子診断用プライマーを開発した｡そして､異なるプラスミドを保有するC.血m姐が日本にも侵淫していることを初めに明かにした｡これら一連の研究は､Q熱の診断および疫学に有用な情報を提供し､Q熱の防御に極めて重要であると考えられる｡審 査 結 果 の 要 旨Cbズje肋わ〟mgfffは人獣共通の病原体で世界各国に広く分布している｡宿主域は家畜､愛玩動物､野生動物および鳥類など極めて広い｡感染動物はほとんど症状を示さないが､ヒトの本症は急性呼吸器疾患､肝炎および心内膜炎などを呈し､欧米では古くから重要な疾患として関心が高い｡申請者の属する研究室ではこれまでに､血清学的および病原学的研究から､日本にもCゎびrne扇がヒトおよび動物に広く侵淫していることを明らかにしてきた｡しかし､日本分線C如m血株の分子生物学的性状およびヒトQ熟の分子疫学については十分理解されていない｡申請者は､本研究において､急性および慢性例由来株の27-kDa外膜蛋白質の遺伝的および抗原的性状を解析し､得られた情報により､Q熟の診断および疫学調査に有用な方法を開発した｡さらに､日本のヒトQ熟の分子疫学についても検討した｡C如me班の国外分離11株(急性例由来5株､慢性例由来5株およびヤギ流産胎仔由来1株)および国内分離10株(ウシ由来5株､ダニ由来3株､ウシ流産胎仔由来1株およびヒト急性例由来1株)計21株のcom上達伝子の塩基配列を決定した｡21株の塩基配列を比較解析した結果､COmJ遺伝子の塩基および推定アミノ酸配列は株間で相同性が極めて高いが､慢性例由来株に特異的な塩基およびアミノ酸残基がみられた｡Cbumedfの21株はc｡m上達伝子の特異的な塩基および推定アミノ酸により4群に分けられた｡国外急性例由来4株と国内ダニ､生乳および急性例由来10株は1群に､国外慢性例由来の2および3株はそれぞれ2および3群に､国外急性例由来1株およびヤギ流産胎仔由来1株は4群に属した｡以上のように､ウシ､ダニおよびヒト急性および慢性例由来株は､塩基配列で異なり､C.血MⅥe出株の鑑別に有用であることが示唆された｡ サC.buJⅥe班の27-kDa外膜蛋白質のアミノ酸残基がどのような抗原決定基をコードする澄明確にするため､急性および慢性例由来計8株からの∝肝止遺伝子を発現ベクターpET21cにクロニングし､大腸菌に発現させた｡SDS-PAGEおよびimmunoblotbng法により､8株の組換え体はすべて分子量約32および30K払の蛋白質を発現していることが確認された｡発現蛋白質はC.bu∫ne班免疫血清および27-kDa外膜蛋白質を認識するモノクロナール抗体とすべて反応することから､少数のアミノ酸の相異にもかかわらず､8株の27-kDa外膜蛋白質には共通な抗原決定基が存在することが判った｡一方､精製した27一肋発現蛋白質はELBA抗原として有用であることをQ熱ヒト血清を用いて評価した｡すなわち､発現蛋白質およびNine MileⅡ相菌を抗原として用い比較したところ､Ⅳ陽性の40検体は全例が陽性で､Ⅳ陰性の20検体は全例が陰性であった｡この結果から､27-kDa発現抗原を用いたELISA法は､特異性が高く､抗体検出に有用であることが示唆された｡C…H遺伝子の塩基配列からプライマ⊥を設計し､新しい遺伝子診断法を開発した｡設計したNes†edPCR用プライマーの特異性はC.bumedj21株および他の微生物を用いて確認された｡すなわち､C.bumeLiL21株からは標的の438bpDNA断片が増幅され､他の微生物-184-からは増幅されなかった｡また､増幅産物は制限酵素S5PIおよびSα∫Ⅰにより切断され､C00扉遺伝子特異的な塩基配列であることが確認された｡さらに､開発したNested PCR法はC･bume班の検出に有用であることをヒトQ熱血清を用いて評価した｡すなわち､Ⅳ陽性155血清中135例から､また､Ⅳ陰性100血清中10例から､00血遺伝子断片が増幅された｡以上の結果から､COm)it伝子を標的とするNested PCR法は､特異性が高く､C.bume出の検出に有用であることが示唆された｡C･bumedLプラスミドの検出は､Q熱患者からの81血清を用いて､QpHlおよびQpRSプラスミドのそれぞれに特異的な遺伝子からプライマーを設計しNestedPCRによって行った｡q】Hlプラスミド特異的な塩基配列は81検体中40例(49.4%)から検出され､また伽RSプラスミド特異的な塩基配列は39例(29.6%)から検出された｡また､5検体(8.6%)からは㊥Hlおよび①RSプラスミド特異的な塩基配列が同時に検出された｡12検体(20･7%)からはQpHlおよびQpRSプラスミド特異的な塩基配列が検出されなかった｡以上の結果から､異なるプラスミドを保有するC.bume班が日本にも侵淫していることが示唆された｡また､患者血清からQpRSプラスミドを保有するC.bumedjが検出されたことは､慢性Q熱患者が日本にも広く存在することを示唆している｡QpHlおよびQpRSプラスミドが同時に検出されたことは､これまでに報告がなく､㊥Hlおよび伽RSプラスミド保有株の混合感染､あるいは2種類のプラスミドを保有する株による感染の可能性が考えられた｡申請者は､本論文において､拍血遺伝子の塩基および推定アミノ酸配列は株間で相同性が極めて高いこと､および慢性例由来株に特異的な塩基およびアミノ酸残基が存在することを初めに明らかにした｡また､異なる株の27-k馳外膜蛋白質に共通な抗原決定基が存在すること､および27-k払発現蛋白質はELISA抗原として抗体検出に有用であることを明らかにした｡さらに､CO血遺伝子塩基配列の情報により､新しい遺伝子診断用プライマーを開発した｡そして､異なるプラスミドを保有するC.血me出が日本にも侵淫していることを初めに明かにした｡これら一連の研究は､Q熱の診断および疫学に有用な情報を提供し､Q熱の防御に極めて重要であると考えられる｡以上について､審査委貞全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論文として十分価値あるものと認めた｡-185-

Some Characteristics of com1 Gene Encoding a 27-kDa Outer Membrane Protein of Coxiella burnetii and Molecular Epidemiology of Q Fever

https://gifu-u.repo.nii.ac.jp/record/74710/files/810053.pdf

Some Characteristics of com1 Gene Encoding a 27-kDa Outer Membrane Protein of Coxiella burnetii and Molecular Epidemiology of Q Fever

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