筑波大学University of Tsukuba博士（医学）Doctor of Philosophy in Medical Sciences2011【要旨】thesi

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輪島, 丈明

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

腸管毒素原性大腸菌の付着因子CS6に関する研究著者 輪島 丈明内容記述 筑波大学博士 (医学) 学位論文・平成24年3月23日授与 (甲第6214号)発行年 2012URL http://hdl.handle.net/2241/117773[339] 氏名(本籍) 輪わ 島じま た丈け あ明き (東京都)学位の種類 1専 士(医 学)学位記番号 1専 甲 第 6214 号学位授与年月日 平成 24年3月23日学位授与の要件 学位規則第4条第 1項該当審査研究科 人間総合科学研究科学位論文題目 揚管毒素原性大揚菌の付着因子 CS6に関する研究王 査 筑波大学教授 獣医学博士 八神健高リ 査 筑波大学准教授 博士(医学) 粛藤慎一高リ 査 筑波大学講師 博士(医学) 福田邦明長リ 査 筑波大学教授(連携大学院) 博士(医学) 倉根一郎論文の内容の要旨(呂的)腸管毒素原性大腸菌 (ETEC)は発展途上国における乳幼児下痢症や先進留で、散発する渡航者下痢症の主要な原因菌であり、発展途上国では年間の死者数が約 38万人にのぼり、その大部分5歳以下の乳幼児が占める深刻な疾患であるロ ETECは3つの主要な病原因子(易熱性毒素、耐熱性毒素、付着因子)を産生し、そのなかで付着因子は ETECの小腸粘膜への定着に必須であり、付着因子の欠損では感染が成立しないことから、治療および予防の標的として注目されている。付着因子のひとつである CS6は特に途上国を中心にその保有株の割合が急激に増加しているが、 CS6による付着機構やCS6自身の分子的性質や発現機構はほとんど明らかにされていない。本研究では、 ETEC臨床分離株を用い CS6の成熟機構、腸管上皮細胞への付着機構およびCS6のもつ ETEC感染における機能を明らかにすることを目的とした。(対象と方法)ETEC臨床分離株として、インド西ベンガル州立感染症病院で水様性下痢症患者から分離された4266株と、同病院で健常人より分離された 3020株を用いた。これらの株は CS6のみを付着因子として産生し、 4266株はCssAICssBI型、 3020株は CssAIICssBII型の CS6サブタイプを示す。まず、 4266株の各CS6遺伝子の欠損株を作製し、それらの株のヒト腸管上皮細胞株への付着性を評価した。また、 CS6の構造タンパクであるCssA、CssBを精製し、細胞分画法や免疫沈降法により、 CssAとCssBの局在および相互作用の解析を行った。次に 4266株および3020株の CS6遺伝子をクローニングし、次世代シークエンサーを用いて塩基配列の解読を行うとともに、部位特異的変異導入や CS6欠損株を作製し付着性の違いを確かめた。さらに、非細胞侵入性株である実験室系統大腸菌のTOPIOにCS6を発現させた株 (TOPIOpCS6)および4266株の CS6欠損株を作製し、細胞侵入における CS6の寄与を検討した。(結果)CS6を構成する 4つのサブユニットの欠損株を構築し、細胞への付着性およびCS6の分子成熟を解析したところ、 CssAはCssB非存在下でmRNAレベルで、は存在するが、タンパクレベルでは安定に存在できなかった。また、細胞分画のウエスタン解析、菌体外膜の蛍光染色の結果、 CS6のいずれのサブユニットが欠けて765 もCS6は外膜上に発現せず、 ETECの付着性も消失した。CS6を介した付着はCssB抗体で阻害され、 CssA抗体では阻害されなかった。また、 CS6変異体の細胞への付着はCssBII型を持つものが非発現株と同程度まで減少した。部位特異的変異導入により CssBIの118番目のリジンにアミノ駿置換を導入すると、付着性が消失した。 CS6のプラスミド塩基配列解析の結果、同一プラスミド上に traオベロンおよびトキシン・アンチトキシン系が存在していた。4266株はCaco-2細胞内に侵入し、後期エンドソームの内部で増殖することが観察された。 CS6欠損株の細胞侵入は強く抑制され、一方で非侵入性株である TOP10にCS6を発現させると細胞内に侵入した。TOP10 pCS6による細胞侵入は、アクチン重合の阻害剤およびPI3K阻害剤により有意に減少し、感染細胞の付着態体周辺にアクチンの集積が認められた。(考察)以上の結果より、 CS6はいずれか1つのサブユニットの欠損で、正常に成熟しないことが示された。また、CS6の細胞への接着を担う責任分子はCssBであり、その中でも特に 118番目のリジンが重要であることが明らかとなった。 CS6のプラスミド上の遺伝子を解析したところ、接合伝達に関わる traオペロン、プラスミドの脱落を防ぐトキシン・アンチトキシン系が存在していた。これらはCS6の伝達や安定化に関与している可能性を示唆している。また、 CS6は細胞侵入因子である可能性が示され、 CS6を介した細胞侵入は、 PI3Kを含むシグナル伝達の結果、アクチン重合が促進されることに起因すると考えられた。細胞侵入したETECは細胞内で増殖することから、 ETECは細胞侵入性菌である可能性が示された。審査の結果の要旨本研究で示されたCS6の分子成熟機構や付着責任分子の解明は、付着因子を標的とした治療・予防法への応用につながる知見である。今後は、 CS6受容体を同定しCS6による付着・侵入機構の完全解明をE指すとともに、 ETEC感染のinvivo実験系の構築を通じて細胞侵入や病態発現機構の解明へと研究の進展が期待される。平成23年 12月26B、学位論文審査委員会において、審査委員全員出席のもと論文について説明を求め、関連事項について質疑応答を行い、最終試験を行った。その結果、審査委員全員が合格と判定した。よって、著者は博士(医学)の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。766 

腸管毒素原性大腸菌の付着因子CS6に関する研究

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