筑波大学University of Tsukuba博士（医学）Doctor of Philosophy in Medical Sciences2010【要旨】Joint authors: Kenji Yamato ... et al.Offprint. Originally published in: Cancer science, v. 102, no. 3, pp. 605-613, 2011thesi

88949

遠藤, 慎治

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

Potent in vitro and in vivo antitumor effectsof MDM2 inhibitor nutlin-3 in gastric cancercells著者 遠藤 慎治内容記述 Thesis (Ph. D. in MedicalSciences)--University of Tsukuba, (A), no.5823, 2011.3.25Joint authors: Kenji Yamato ... et al.Offprint. Originally published in: Cancerscience, v. 102, no. 3, pp. 605-613, 2011Includes bibliographical references発行年 2011その他のタイトル ヒト胃癌細胞に対するMDM2阻害剤nutlin-3の抗腫瘍効果に関する研究URL http://hdl.handle.net/2241/114540[302] 遠えん 藤とう 慎しん 治じ (東京都)1専 土(医 学)博甲第 5823 号氏名(本籍)学位の種類学位記番号学位授与年月日学位授与の要件審査研究科学位論文題目、????平成 23年3月25日学位規則第4条第 l項該当人間総合科学研究科Potent in vitro and in vivo antitumor effects of MDM2 inhibitor nutlin・3in gastric cancer cells (ヒト胃癌細胞に対する MDM2阻害剤 nutlin-3の抗)j重傷効果に関する研究)????医学博士医学博士博士(医学)博士(医学)JlI上康内田和彦筑波大学教授筑波大学准教授筑波大学講師筑波大学講師小田竜也佐藤豊実論文の内容の要旨(目的)本邦における胃癌擢患率及び進行期での死亡率は高く、既存化学療法の治療成績は悪いため、新規治療薬の開発が必要である口胃癌組織における t53変異率は約 30%であるが、残りの 70%においては p53のdown-regulationによる機能低下が提唱されており、野生型t53のup-regula tionを介した celcycle arrestやapoptosisが効率良く誘導されれば、抗腫蕩効果の増強となる o p53の機能抑制j癌蛋白として、 murinedouble minute 2 (MDM2)や MDM4が知られており、 MDM2はp53と複合体を形成後、ユビキチン化を介した分解を誘導する o l¥在DM2の選択的阻害作用を有する分子標的治療薬 nutlin-3は、造血器腫蕩などに対する有効性が報告されているが、胃癌に対する有効性を示した報告はなし、。本研究は、胃癌縮胞に対する nutlin-3の抗腫蕩効果を znvztro及びznVlVOにて検証する自的で行われた。(対象と方法)ヒト胃癌細胞 t53野生株4種類(町医N-45，NUGC-4， STKM-2， SNU-1) P53変異株3種類 (NUGC-3，NUGC-2， STKM-l) コントロールとして用いた細胞株MDM2過剰発現細胞株 (S]SA-1: osteosarcoma) MDM4過剰発現細胞株 (Weri-1: retinolコlastoma)恥1DM2. l¥在DM4過剰発現細胞株 (MCF-7:乳癌細鞄株)1) ヒト胃癌綴胞株における p53，MDM2， MDM4， p 14¥1<1'の発現レベルを Westernblotting法にて解析し、MDM2， .MD.M4癌遺伝子増幅について QuantitativeR下PCRi去にて解析した。2) t53野生株4種類及び、戸53変異株 1種類 (NUGC-3)をnutlin-3と72時間共培養し、抗臆場効果についてWST-8 assayにて評価した。3)同様に、 10μMnutlin-3との共培養0，4， 8， 24時間後における、 p53シグナル下流蛋白 (p21，Noxa， Cleaved PARP)の発現レベルについて、 Westernblotting法にて解析した。666 4)戸53野生株3種類(叩くN-45，NUGC-4， SNU-1)及び戸53変異株 1種類 (NUGC-3) を10μMnutlin-3と共培養し、 celcyc1e arrestや apoptosis誘導について、 Flowcytometryにて解析した。5)戸53野生株4種類を nutliル3(1， 2，5μM) と5-FU(0.25， 1)1M)あるいは cisplatin(1)1M) と共培養し、薬剤相互作用について、 Combinationlndex-isobologram法にて評価した。6) in vivoにおける nutli什3の抗J重蕩効果について、開くN-45皮下移植マウスを用い評価した。þ53 野生株聞くN-45 細胞浮遊液を 5~6 週齢のヌードマウス右大腿部皮下へ移植し、騒蕩体積平均値が約100mm:lに達した時点で、コントロール群と治療群とに割り付けした。治療群として、 nutlin-340mg/kg投与群、 5-FU 40mg/kg投与群、 nutlin-340mg/kg及び5-FU40mg/kg併用投与群を各々設け (n二6)、隔日にて 6回腹腔内投与し、各群の腫傷容積の評価を行った。コントロール群には伺量の DMSOの投与を行った。(結果)戸53野生株4種類のうち、開くN-45では、 MDM2遺伝子増幅を伴った恥1DM2蛋白の過剰発現が認められ、SNU-lでは MDM4蛋白の過剰発現が認められたが、 MDM4遺伝子増幅は認められなかった。 NUGC-4，STKM-2については、 MDM2及びMDM4何れの遺伝子増幅も蛋白の過剰発現も認められなかった。各戸53野生株に対し、nutlin-3はMDM2/MDM4遺伝子増幅あるいはMDM2IMDM4蛋白の過剰発現の有無に関わらず、WST-8 assayにて、顕著な抗腫蕩効果を示した。また、 nutlin-3投与後の p53シグナル下流蛋白 (p21，Noxa， Cleaved PARP)発現レベルの変化について、 Westernblotting i:去にて解析したところ、 24時間までに何れの下流蛋白も強発現していた。 Flowcytometryでは、コントロール群に比し、 10)1Mnutlin-3投与群では有意にcel cycle arrest及びapoptosisの誘導が認められた。一方、ヒト胃癌縮胞t53変異株NUGC-3において、nutlin-3の抗腫蕩効果は認められなかった。既存の化学療法薬との併用効果について、 5-FUとcisplatinとの相互作用に関して検討を行ったところ、5・FUとは主に相加効果が、 cisplatinとは相乗効果が認められた。叩¥:N-45皮下移植ヌードマウスを用いた動物実験において、 nutlin-3治療群では有意な抗麗蕩効果が認められ、 5-FUとnutlin-3との併用群では、 5・FU単独治療群及びnutlin-3単独治療群との比較にでも有意な抗麗場効果が認められた。(考察)ヒト胃癌細胞の MDM2及びMDM4蛋白発現レベルは様々であったが、全ての戸53野生株において、nutlin-3はp53のup-re忠llationを介した celcycle arrestや apoptosisを誘導し、抗腫蕩効果を示した。一方、戸53変異株において、抗腫傷効果は全く認められず、その作用は戸53遺伝子statusに依存することが示唆された。 MDM4過剰発現細胞株SNU-1では、 nutlin-3は有意な抗腫蕩効果を示した。 MG132を前投与したSNU-lでは、 nutlin-3投与後の MDM4発現抑制が認められなかったことから、 nutlin-3の投与後に発現誘導された MDM2がproteasome系での MDM4分解を促進したとものと考えた。聞くN-45皮下移植ヌードマウスを用いた動物実験では nutlin-3治療群で有意な抗腫蕩効果が認められた。消化器癌に対する化学療法で最も中心的な薬剤である 5・FUとの併用で、有意な抗腫蕩効果の増強を示し、その耐容性も確認されたことから、今後の臨床応用が期待された。審査の結果の要旨MDM2阻害剤 nutlin-3は、野生型t53遺伝子を有する胃癌細胞に対して抗腫蕩効果を示し、今後、胃癌に対する有望な治療薬となりうる可能性を示唆した。胃癌の化学療法の新規併用薬剤としての実用化に向けた基礎的論文として価値ある論文である。よって、著者は博士(医学)の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。667 

ヒト胃癌細胞に対するMDM2阻害剤nutlin-3の抗腫瘍効果に関する研究

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Tsukuba Repository (Tulips-R)