筑波大学University of Tsukuba博士（医学）Doctor of Philosophy in Medical Sciences2003【要旨】Joint authors: Masatsugu Ema ... et althesi

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Terunuma, Tsumoru

照沼, 積

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

Reduced gene dosage of GATA factors inducesdeafness in mice due to the degeneration ofspiral ganglion cells著者 照沼 積内容記述 Thesis (Ph. D. in MedicalSciences)--University of Tsukuba, (A), no.3457, 2004.3.25Includes bibliographical referencesJoint authors: Masatsugu Ema ... et alIncludes supplementary treatises発行年 2004URL http://hdl.handle.net/2241/1278　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　119刊　　　　　　　　　　　てる　　ぬま　　　　　つもる氏名（本籍）　照沼　　積（茨城県）学位の種類　博　士（医　学）学位記番号　博甲第3457号学位授与年月日　　平成16年3月25日学位授与の要件　　学位規則第4条第1項該当審査研究科　　医学研究科学位論文題目　　馳曲鋤g鱗曲S聯◎管GA猟胞C敏S…耐鰐S細誠弼鱗1胴前鵬曲帥◎細　　　　　　　　　　　能蟹餉餅説1◎醜耐S騨楠1g餓釧◎蘭C銚§　　　　　　　　　　　（GATA因子欠損マウスにおける難聴発生機構の解析）主査　筑波大学教授　　医学博士　　大鹿哲郎副査筑波大学客員教授　理学博士　　石井俊輔　　　　（独立行政法人　理化学研究所）副　査　　筑波大学助教授　　　獣医学博士　　　　杉　山　文　博副査　筑波大学講師　　博士（医学）　谷中清之論文の内容の要旨（目的）　GATA転写因子群は，様々な臓器の発生過程において重要な役割を果たす転写因子である。そのうち，GATA－3は内耳の発生過程で発現し，内耳の形成において重要な機能を有することが明らかになっている。最近，ヒトでのGATん3遺伝子のハプロ不全がHDR症侯群（h卿op欲a曲Woidism，senso㎡鵬鮒創deぬess，rena1ano㎜a丑y1副甲状腺機能低下症，感音性難聴，腎形成不全）を引き起こすことが報告された。また，GATA－2の内耳での発現はニワトリを用いた系で解析されているが，発生の初期段階の解析のみで，詳細な報告はない。本研究では，内耳，とくに蝸牛におけるGATん2およびGATん3の役割をGATん2ヘテロマウス，GATん3ヘテロマウス，GATん2：：GATん3二重ヘテロマウスを用いて解析した。（対象と方法）　内耳でのGATん2の発現を，GATへ一2GFPノックインマウスを用いて解析した。次に，難聴を評価するために，ABR（＆u砒orybr＆呈鵬te㎜respo双se1聴性脳幹反応）を野生型マウス，GATA－2ヘテロマウス，GATん3ヘテロマウス，GATん2＝：GATん3二重ヘテロマウスにおいて行い，同時に組織学的，分子生物学的解析を行った。組織学的解析としてHE染色，GATん2の発現をみるためのGFP免疫染色，GATん3の発現をみるためのLacZ染色を行った。分子生物学的解析として，TUNEL法によるアポトーシスの評価を行い，発現遺伝子の解析として蝸牛とくにラセン神経節よりRNAを抽出し，RT－PCR法を行った。（結果）　GATん2の内耳での遺伝子発現はE1O．5より確認され，生後5ケ月齢を過ぎてもラセン神経節で観察された。ABRの結果，生後2ケ月齢でGATん2ヘテロマウスおよびGATん3ヘテロマウスは野生型マウスに比べて，難聴は認められなかったが，GATん2：：GATん3二重ヘテロマウスでは軽度から中程度の難聴が認められ，生後5ケ月齢では高度の難聴を示した。形態学的には，HE染色上，出生直後では明らかな形態異常は認められなかったが，2ケ月齢でGATん2＝：GA皿一3二重ヘテロマウスにおいてラセン神経節細胞が減少しており，一421一5ケ月齢ではさらにラセン神経節細胞の減少は進行していた。ラセン神経節細胞の減少がアポトーシスによるものかどうか確認するためにTUNEL法を行ったところ，GATA－2：：GATA－3二重ヘテロマウスでのTU－NEL陽性細胞が確認された。GATA－2およびGATA－3の標的部位を調べるために，GA蛆一2に対してGFP免疫染色，GATA－3に対して肋cZ染色の二重染色を行ったところ，ラセン神経節において発現の重複が認められた。GA皿一2およびGATA－3の下流遺伝子を同定するために，ラセン神経節のRNAを抽出し，RTPCR法を用いて遺伝子発現を解析したところ，GATA－2：＝GATA－3二重ヘテロマウスにおいてはラセン神経節の発生と維持に関係している丁欣C，BDNFの発現が有意に低下していることが明らかになった。（考察）　GATA－2：：GATA－3二重ヘテロマウスにおいて進行性の難聴が認められたが，その原因としてTrkC，BDNFの発現が低下し，アポトーシス尤進によるラセン神経節の減少が考えられた。またGATA－2およびGATA－3は，内耳の発生に重要であると考えられた。とくに蝸牛のラセン神経節の発生と維持に関して，GATA遺伝子の量が重要であることが示唆された。GATA－2：：GATA－3二重ヘテロマウスは，HDR症侯群における感音性難聴のモデルマウスになるのではないかと推測された。（結論）　GATA－2：：GATA－3二重ヘテロマウスにおいて進行性の難聴がみとめられ，TrkC，BDNFの発現が低下し，アポトーシス充進によるラセン神経節の減少が認められた。審査の結果の要旨　本研究は，GATA転写因子群のうちGATA－2およびGATA－3の内耳，とくに蝸牛における役割を機能面から初めて解析した研究で，有意義な内容である。GATA－2ヘテロマウス，GATA－3ヘテロマウス，GATA－2：＝GATA－3二重ヘテロマウスを詳細に解析し，GATA－2およびGATA－3が内耳の発生に重要であること，GATA－2：：GATA－3二重ヘテロマウスが進行性の難聴を示し，その原因がTrkC，BDNFの発現低下によるラセン神経節の減少であることを明らかにした。興味深い知見を得ており，充分評価できる優れた研究である。　よって、著者は博士（医学）の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。一422一

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