筑波大学University of Tsukuba博士（理学）Doctor of Philosophy in Science1996【要旨】thesi

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Yang, Heping

楊, 和平

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

Studies on molecular characterization andchromosomal mapping of AtECP genes inarabidopsis thaliana (L.) heynh.著者 Yang Heping内容記述 Thesis (Ph.D. in Science)--University ofTsukuba, (A), no. 1608, 1997.1.31発行年 1997URL http://hdl.handle.net/2241/5441　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　臣旧　　　　　　　　　　　よう　　　　　　わ　　へい氏名（国籍）楊和平（中国）学位の種類博士（理学）学位記番号　博甲第1，608号学位授与年月日　　平成9年1月31日学位授与の要件　　学位規則第4条第1項該当審査研究科　生物科学研究科学位論文題目　　S池舶so竈胴餓1銚C胎τ鈍重e漉細鋼dC汽㈱◎s◎醜1晩p帥g◎酋焔艀Ge潮　　　　　　　　　　　1糀屈κa肋doρs旭流a〃a〃凄　（し）　汽ey漏院．　　　　　　　　　　　（シロイヌナズナにおけるんECP遺伝子の分子生物学的解析と染色体上の座位決定）主　査　　筑波大学教授　　　理学博士　　鎌　田　　　博副査　筑波大学教授　理学博士　猪川倫好副査　筑波大学教授　農学博士　酒井慎吾副　査　　筑波大学助教授　　理学博士　　林　　　純　一論文の内容の要旨　高等植物においては，動物とは異なり，特殊な機能を持つように分化した体細胞であっても，適切な条件下におかれると新たに胚発生を開始して植物個体を再生することができる。このような体細胞不定胚形成については，これまでニンジンを中心に解析が行われ，体細胞が不定胚形成能を獲得する際に新たに特異的に発現してくる遺伝子としてDCECP遺伝子が同定・単離されてきた。しかし，分子生物学的手法のみによって単離された遺伝子の真の生理機能を探るための一般的な方法は確立されておらず，DCECP遺伝子についても，不定胚形成におけるその真の生理機能や植物個体における生理機能についてはこれまで全く明らかにされていないばかりでなく，ニンジンでは一世代時聞が約2年と長いことから突然変異体を用いる遺伝学的解析も困難である。そこで，本論文では，真に重要な生理機能を担っている遺伝子は多くの植物に共通に存在しているとの考え方のもとに，多数の突然変異体が単離され，遺伝学的解析やゲノム解析が進んでいるシロイヌナズナを用い，DCECP遺伝子の相同遺伝子をシロイヌナズナから単離し，染色体上でのその遺伝子座位を決定している。　本論文では，まずはじめに，ニンジンから単離された各種DCECP遺伝子の相同遺伝子がどのような植物種に存在しているかを確かめるため，シロイヌナズナばかりでなく，ナスやアスパラガスなどのゲノムDNAを用いて解析し，DCECP31遺伝子とDCECP63遺伝子の相同遺伝子がこのような植物全てに存在することを示した。そこで，DCECP3王遺伝子とDCECP63遺伝子をプローブとして用い，ノーザン法によってシロイヌナズナにおける発現部位を解析し，その結果，成熟果実（種子）中でこのE　C　P類似遺伝子が発現していることを明らかにした。次に，DCECP3ユ遺伝子とDCECP63遺伝子をプローブとして用い，シロイヌナズナの成熟種子から調整したcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより，DCECP31遺伝子およびDCECP63遺伝子のシロイヌナズナにおける相同遺伝子であるAtECP31遺伝子およびAtECP63遺伝子の全長cDNAの単離に成功した。　次に，AtECP31遺伝子について，ノーザン法による発現解析やサザン法によるコピー数の解析および塩基配列解析等により，本遺伝子は256アミノ酸からなるタンパク質をコードしており，種子胚発生の後期に特異的に蓄積されるLEAタンパク質の一種で，シロイヌナズナではこれまでに報告のないグループ5のLEAタンパク質に属する新規な遺伝子であることを明らかにした。一方，多数の制限酵素について詳細な検討を行うことで，ゲノムDNAを用いた制限酵素断片長多型（RFLP）を示す制限酵素を探し出した。さらに，シロイヌナズナの持つ一32一5本の染色体上にそれぞれマーカーとなる突然変異を有するLapdsbergのW－100株と正常なCo1u磁bia株の交配後の第2世代について，突然変異形質の分離とRFLPパターンの分離を詳細に比較することで，AtECP31遺伝子がシロイヌナズナの第3染色体上に位置することを明らかにした。AtECP31遺伝子の第3染色体上での座位をさらに詳細に検討するため，増幅断片制限酵素多型配列（CAPS）解析を行い，AtECP31遺伝子は第3染色体の28．3－29．6センチモルガン（cM）の位置に座乗することを明らかにした。　一方，AtECP63遺伝子についてもAtECP31遺伝子と同様の解析を行い，A重ECP63遺伝子が449アミノ酸からなる親水性の高いタンパク質をコードしており，シロイヌナズナではこれまでに報告のないグループ3のLEAタンパク質に属する新しい遺伝子であることを明らかにした。さらに，RFLP解析とCAPS解析を行い，AtECP63遺伝子がシロイヌナズナの第4染色体上に存在しており，その座乗位置は67．6－8414cMの位置であることも明らかにした。　本研究では，ニンジンの不定胚形成能獲得に関与すると考えられるDCECP遺伝子の真の生理機能を探ることを最終目標に，多数の突然変異体が単離され，遺伝学的解析やゲノム解析が飛躍的に進んでいるシロイヌナズナを用い，DCECP遺伝子の相同遺伝子の単離・解析が行われているが，本実験で単離された遺伝子の真の生理機能を探るためには既報の突然変異体との一致を明らかにする必要があり，現在，AtECP31遺伝子とAtECP63遺伝子が座乗する位置の近傍には多数の胚発生突然変異体の存在が報告されるようになってきていることから，AtECP遺伝子がこのうちのどの突然変異体を相補するかに関する研究が進められているところである。審査の結果の要旨　本研究は，体細胞不定胚形成という高等植物に特徴的な現象を解析するためにこれまで主な材料として用いられてきたニンジンで単離された胚発生に関与すると考えられる遺伝子について，その真の生理機能を探る際のニンジン自身が持つ問題点，すなわち，世代時聞が極めて長いために突然変異体を用いる真の生理機能の解析ができない材料としての問題点を克服するため，多数の突然変異体が次々と単離され，遺伝解析やゲノム解析が急速に進んでいるシロイヌナズナを用い，ニンジンで単離された遺伝子の相同遺伝子をシロイヌナズナから新たに単離し，その遺伝子の特性解析を行うと同時に，その遺伝子のシロイヌナズナにおける座乗染色体の決定と染色体上での座乗位置を明らかにしたものである。本研究は，分子生物学的技法によって単離されたもののその真の生理機能が不明な遺伝子の生理機能を明らかにするための新しい方法論を提供するものであり，極めて重要な研究と評価される。また，本研究で初めて単離されたシロイヌナズナのAtECP遺伝子の特性解析の結果は，種子胚の発生や成熟に関する研究領域に貴重な基礎資料を与えるものと評価できる。　よって，著者は博士（理学）の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。一33一

Studies on molecular characterization and chromosomal mapping of AtECP genes in arabidopsis thaliana (L.) heynh.

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