筑波大学University of Tsukuba博士（医学）Doctor of Philosophy in Medical Sciences1984Includes a supplementary treatise (in Japanese)doctoral thesi

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Takada, Akira

高田, 彰

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

Transport and metabolism of glutathione andsulfur-containing amino acids in primarycultured rat hepatocytes著者 Takada Akira内容記述 Thesis--University of Tsukuba, D.M.S.(A), no.310, 1985. 3. 25Includes a supplementary treatise (inJapanese)発行年 1985URL http://hdl.handle.net/2241/6011臣5ヱ週氏　名（本　　籍）学　位　の　種類学　位　記番　号学位授与年月日学位授与の要件審査研究科学位論文題目主査　筑波大学教授副　査　　筑波大学教授副査　筑波大学教授副　査　　筑波大学教授副査　筑波大学教授たか　　　　だ　　　　　　　　　あきら高　田　　　彰（滋賀県）医　　学　　博　　士博甲第310号昭和60年3卓25日学位規則第5条第1項該当医学研究科　生理系専攻初代堵護ラット肝細胞における含硫アミノ駿およびグルタチオンの輸送と代謝医学博士医学博士医学博士医学博士大　　菅　　俊　　明滝　　日ヨ　　　　齊東　　　　　悪　　彦吉　　川　　靖　　三内　　山　　安　　男論　　文　　の　　要　　旨　g1uta伽㎝e（GSH）は生体内に最も多量に存在する倣o1化合物であり，生体内の酸化還元状態の調節や，毒物の解毒代謝，ならびに放射線障害に対する防禦など重要な機能をはたしている。肝臓はGSH合成の主要な場であり，多量のGSHが貯蔵されている。GS貫の合成は，肝細胞内のcys－teine濃度に依存しており，細胞外の㎜ethioni舵，CySte1皿e，およびCyStiηeがCySteineの供給源として利用される。本研究においては，これらの含硫アミノ酸の細胞内への輸送という点に注目し，肝細胞におけるGSH代謝と含硫アミノ酸の輸送活性の関係について検討した。特に，知見の乏しかったCyStine輸送について，CyStine輸送系の同定と，輸送系の活性を調節する因子について検討し，，その生理的な意義について考察を加えた。　（2）研究方法　体重150～200gのWistar系ratを用い，co11agenase灌流法により単離肝細胞を得た。これを10％の仔牛血清を含むW111ia㎜s’E培地中で初代単層培養した。培養は，55％CO。，95％空気の気相下でおとなった。　細胞内のアミノ酸およびGSHの定量は，細胞を洗浄した後に5％汰ichoracetic　acid（TCA）で，酸可溶画分を抽出し測定した。アミノ酸の輸送速度は，細胞を洗浄後，R亙で標識されたアミノ酸’（2μα／腿ゼ）を含む敢り込み液と一定時聞1n㎝bateさせ，この後RIを洗い流し，．5％TCAで細胞内に取り込まれたRIを抽出して測定した。一120一　（3）結果および考察　（i）培養肝細胞内GSH量の変化　単離直後の肝細胞内GSH量は低下していたが，培養開始後は急速に回復し，培養24時閻までは高値を保った。しかし，培養48時問以降はGSH量は再度低下した。これはWmia㎜s’E培地申に含まれる狐ethioni鵬量が不足していることに起因することが，細胞内および培地申のアミノ酸分析より示唆された。　（i1）鵬舳onine，cysteine，およびcystineの培地への添加と細胞内GSH量の上昇　培地申に磁ethioni鵬又はcysteineを添加した場合には細胞内GSH量の急激な上昇が認められたが，cystineの添加ではGSH量上昇の程度は軽度であった。この原因は，cystineの細胞内への輸送が他の2つのアミノ酸に比して極めて遅く，肝細胞が十分にcystineを利用できないことに原因することが示された。　（剛培養肝細胞におけるCyStine輸送系の同定　培養開始直後にはcystineに対して高い特異性を示す輸送系は認められなかった。培養24時問以　　　　　　　　　　　　　　　　　　寺降，cystineに対して特異性が高く，Na非依存性の輸送系の活性が誘導され，培養48時聞では，　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　キcystineは大部分この輸送系を介して輸送されるようになった。g1耐a聰ateはこのNa非依存性のcystine輸送を競合的に阻害したことから，誘導された輸送系は，坂内らがfibrob1astにおいて報告した輸送系（Xε）と同等のものであると考えられた。　（i・）CyStine輸送系の活性を調節する因子　insu1inとdexa皿ethas㎝eは濃度依存性にcystine輸送系の活性を高めた。培養細胞の密度と輸送活性は逆相関関係にあり，低細胞密度においてCyStine輸送の活性が高かった。また肝細胞をSu1－fobro㎜ophtha1ein（BSP）などの親電子試薬の存在下で培養すると，cystine輸送系の活性は著明に上昇した。　（・）cystine輸送系による肝細胞内GSH量の調節　肝細胞をBSPの存在下で培養すると細胞内のGSH量は一担低下するが，9～12時間後より，GSH量の増加が認められた。このGSH量の再上昇は，時間的にcystine輸送系の活性上昇にひき続いておこり，又，高濃度のgluta㎜ateの添加で抑制されたことから，CyStine輸送系の活性上昇により，肝細胞のcystine利用の効力が高まり，cystineがGSH合成に利用されやすくなった結果と考えられた。　（4）要　　約　（i）培養肝細胞は㎜ethionineとcysteiBeを効率良く利用することができたが，cystineは細胞内への輸送速度が極めて遅いことから，その利用効率が悪かった。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　十（ii）しかし，培養肝細胞においてcystineに対して高い特異性を持つNa非依存性のアミノ酸輸送系が存在することが認められた。　㈹この輸送系の活性はipsu1iη，dexa㎜etbas㎝e，低細胞密度，およびBSPなどの親電子試薬で促進された。特にBSPによる促進は著明であり，肝細胞のGSH量の調節にcystine輸送系の活性が密一121一接に関与している可能性が示された。　（1・）現在広く使用されているW1l1i狐s’E培地に含まれるmethi㎝ineの量は肝細胞内のGS貫を長時聞高値に保つには不足している。審　　査　　の　　要　　旨　本申請論文は，dissertati㎝形式としては模範的なものと思われる。　論文内容もJ．Bio1ogical　Che服is吉ryに採用されたことで明らかなよう一に高水準のものである。す　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　十なわち，培養肝細胞のCyStine輸送にも特異的なNa非依存性機構の存在することを初めて明らかにし，さらにステロイドホルモン，インスリン，BSPにて本輸送機構が賦活されることを示した。本輸送系は肝細胞内GSH合成の調節に関与するという意昧で，その生物学的意義が高い。　よって，著者は医学博士の学位を受けるに十分な資格を有するものとみとめる。一122一

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