In this letter, we report the method of extraction of rubbery material from stem of Ficus variegata produced latex. The rubber component was extracted by using an ionic liquid as a solvent. The obtained rubber component was 0.05-0.11 %. It is considerably less compared to 30-40 % of latex contained in Hevea brasilliensis. Natural rubber consists of cis-1,4-polyisoprene. The F. variegata rubber was suggested to be closely similar to cis-1,4-polyisoprene by comparison of its 1H and 13C-NMR and infrared absorption spectra with those of authentic 97 % cis-1,4-polyisoprene. These analysis results indicate that the rubber component of F. variegata consists of cis-1,4-polyisoprene.http://purl.org/coar/resource_type/c_650

Mizobe, Tomoya

Nakasone, Keiko

Tomenaka, Yuma

仲宗根, 桂子

溝部, 智也

留中, 佑真

Japanese

University of the Ryukyus Repository

琉球大学学術リポジトリイオン液体を用いた天然ポリイソプレンの抽出実験－ギランイヌビワ産出ラテックス－言語: Japanese出版者: 琉球大学理学部公開日: 2023-11-28キーワード (Ja): キーワード (En): 作成者: 溝部, 智也, 留中, 佑真, 仲宗根, 桂子メールアドレス: 所属: メタデータhttps://doi.org/10.24564/0002020131URL  緒言  ギランイヌビワ（学名 Ficus variegata Reinw. var. garciae Corner），（Ficus variegata Blume var. garciae Corner）は八重山諸島の石灰岩地域に分布するクワ科の常緑高木である 1)。 さて，天然ゴムを産出する植物は多数あるが，主要な供給源は南米原産のヘベア・ブラジリエンシス（Hevea brasiliensis）である。ヘベア・ブラジリエンシスが産出するラテックス中にはゴム粒子が 30～40％含まれている。そのゴム粒子の表面は脂質とタンパク質の膜によって安定化されている。この樹が産出する天然ゴムは，高重合度のシス-1, 4 ポリイソプレンである 2, 3)。生合成の機構についての解明も進展し 4)，2016 年には生合成に寄与する 3 つのタンパク質が同定され試験管内での天然ゴム合成に成功した 5, 6)。 天然ゴムの精製法については，既に確立されている。ラテックスにタンパク質分解酵素と界面活性剤とを加え，反応後に遠心分離して分解物を除去するという方法である 7, 8)。一方で，有機溶媒の替わりにイオン液体を溶媒として分離・精製に利用する研究が急速に広がってきた。タンパク質は一般に水（緩衝水溶液）以外には不溶であるが，加熱することでイオン液体に溶解するものがある。 著者らは，2012 年より，沖縄県内で生育可能なトウダイグサ科の植物，ミドリサンゴ（Euphorbia tirucalli L.）を手始めに，イオン液体を用いたポリイソプレンの抽出実験を行ってきた。操作が容易で，かつ高純度で抽出する方法を確立しつつ，ポリイソプ  レンを産出する植物の探索を行ってきた 9, 10)。2020年には，この抽出法により，クワ科の常緑高木であるガジュマル（Ficus microcarpa L.f.）が産出するラテックス中に，シス型ポリイソプレンが約 1.7％含まれイオン液体を用いた天然ポリイソプレンの抽出実験 －ギランイヌビワ産出ラテックス－  溝部智也・留中佑真・仲宗根桂子  琉球大学理学部物質地球科学科    Extraction of Rubbery Material from the Stem of Ficus variegata by use of Ionic Liquid  Tomoya Mizobe, Yuma Tomenaka, Keiko Nakasone  Abstract In this letter, we report the method of extraction of rubbery material from stem of Ficus variegata produced latex. The rubber component was extracted by using an ionic liquid as a solvent. The obtained rubber component was 0.05-0.11 %. It is considerably less compared to 30-40 % of latex contained in Hevea brasilliensis. Natural rubber consists of cis-1,4-polyisoprene. The F. variegata rubber was suggested to be closely similar to cis-1,4-polyisoprene by comparison of its 1H and 13C-NMR and infrared absorption spectra with those of authentic 97 % cis-1,4-polyisoprene. These analysis results indicate that the rubber component of F. variegata consists of cis-1,4-polyisoprene. Bull. Fac. Sci. Univ. Ryukyus, No. 114: 55 − 60 (2023) 55溝部智也・留中佑真・仲宗根桂子 イオン液体を用いた天然ポリイソプレンの抽出実験ていることを明らかにした 11)。従来の抽出法との違いは，最初にイオン液体を用いてタンパク質と糖類の除去を行うことにある。今回は，ギランイヌビワが産出するラテックスに対して，同様な抽出法を適用し，ポリイソプレン成分の探索を行った。  実験  1. 材料等 2021 年 11 月に，琉球大学理学部構内に植栽されたギランイヌビワの木の幹からラテックスを採集した。  2. 抽出 常法に従い，ラテックスに含まれているタンパク質，糖類，脂質等の除去とゴム成分の精製を行った。 (1) イオン液体（Emim Ac, Sigma-Aldrich）を投入したサンプル管瓶にギランイヌビワから採集した新鮮なラテックスを注いで，A および B の二種類の濃度の溶液を調整し，それぞれ試料 A および B とした。それぞれの溶液中のラテックスの濃度は，試料 A の溶液では 32.67％，試料 B の溶液では43.88％であった（Table 1）。  Table 1.  Compositions of the latex from F. variegate in the ionic liquid.  (2) これらの溶液を真空恒温槽内で，段階的に85 ℃まで加熱した。なお，水分を蒸発させるため，45 ℃で一晩（約 17 時間）保持した。 (3) 次に，分液ロートを使用して試料 A および Bのイオン溶液から，トルエンを用いて脂溶性のゴム成分と脂質等を抽出した。 (4) ソックスレー抽出器を使用して，トルエン抽出物からアセトンを用いて 6～7 時間かけて脂質などの脂溶性成分を脱脂し，残渣のアセトン不溶部を得た。これをギランイヌビワの幹から抽出・精製されたゴム成分とした。  3. 機器分析 (1) フーリエ変換赤外線吸収 (FT-IR) スペクトルは，フーリエ変換赤外分光光度計 FT-IR-6100（日本分光株式会社）を使用し，4,000～550 cm-1の範囲で測定した。精製後のゴム成分は ATR 法を用い，脂質などの成分は KBr 法を用いて測定した。 (2) 1H (500MHz) - および 13C-NMR(125MHz) スペクトルは，BRUKER AVANCE III 500 装置で測定した。測定溶媒は，クロロホルム-d1, 99.8 %D (0.03 % TMS 含有)，（関東化学株式会社）を使用し，化学シフトは 値で示した。 (3) CHN 元素分析装置は，JM11（株式会社ジェイ・サイエンス）を使用した。 なお，市販品のシス-1,4 -ポリイソプレン（97％ Cis-1,4；Scientific Polymer Products, Inc.）を標品として用い，同様な測定を行い，抽出物との比較・検討を行った。  実験結果  1. 抽出 Fig. 1 に，ラテックスとイオン液体との混合直後（左）と加熱後（右）の様子を示す。混合させた直後は白濁していたが，加熱すると着色しているものの透明な液体になった。    Fig. 1.  Mixture of latex from F. variegata and the ionic liquid. Left side; immediately after mixing. Right side: after heated at 85 °C.  NameSample ASample BWeight percent / %32.6743.8856 57溝部智也・留中佑真・仲宗根桂子 イオン液体を用いた天然ポリイソプレンの抽出実験ラテックスのイオン液体に対する溶解温度は目視で 55 ℃であった。放冷後，真空恒温槽内からサンプル管瓶を取り出し，イオン溶液の液面に薄いゲル状の層が形成されているのを確認した。イオン液体の密度が高いことから，ゴム成分や脂質などの不溶な成分が，加熱中に浮上して集合したものと思われる。 ギランイヌビワの幹から抽出・精製されたゴム成分は，ごく少量で弾性を示す固体として得られた。これらのラテックスに対する質量割合 (%) は，試料 A が 0.11%，試料 B が 0.05%であった。また，アセトンに溶解した脂質などの割合は，試料 A が2.20%で，試料 B が 2.28%であった。抽出過程におけるイオン溶液の質量減少から，ラテックス中の水分は 60％近くあり，タンパク質と糖類などが 40％近く含まれていることが推定された。 なお，天然ゴムのラテックスの組成については，水分が 60％，タンパク質が 2％である。ギランイヌビワのラテックスは，タンパク質等の割合がかなり高いという結果になった。  2. 機器分析の結果  ギランイヌビワの幹から抽出・精製されたゴム成分等に対して，以下の機器分析を行った。  2-1) FT-IR 分析 試料 B から得られたゴム成分の IR スペクトルをFig. 2 に示した。横軸は波数を，縦軸は透過率 (%) を示す。Table 2 に，試料 A および B のゴム成分のIR スペクトルで得られた吸収帯の位置とその帰属を各々示した。比較のために，97% Cis-1,4 の測定値も同時に示した。 高波数側の 2960 cm�� の強い吸収ならびに 1376 cm�� の中程度の強度の吸収帯は ���� 基の C－H結合の逆対称伸縮振動ならびに H－C－H 結合の変角振動に由来するものでメチル基の存在を示唆する。また，2926 cm�� と 2853 cm��の強い吸収帯および 1447 cm�� の中程度の強度の吸収帯は，  Fig. 2.  IR spectrum of the rubber material from F. variegata.   Table 2.  Absorption bands data in the IR spectrum of the rubber material from F. variegata and authentic 97% cis-1,4-polyisoprene (Cis-1,4) and their assignments.    ���� �基の C－H 結合の伸縮振動および H－C－H結合の変角振動に由来するもので，メチレン基の存在を示唆する。さらに，3034 cm�� の鋭い吸収帯はオレフィンの C－H 結合の伸縮振動に，1664 cm�� の弱い吸収帯は C＝C 結合の伸縮振動に，836 cm�� の中程度の強度の吸収帯はオレフィンのC－H 結合の面外変角振動にそれぞれ由来し，部分構造として三置換オレフィン構造 ＞C=CH－の存在を示唆する。 以上の結果から，ギランイヌビワの幹から抽出・精製されたゴム成分は，1, 4-ポリイソプレン重合体と推定され，標品の 97% Cis-1,4 の IR スペクトルと比較した結果，両者はほぼ一致した。 次に，試料 B から得られた脂質等の成分に対するIR スペクトルを Fig. 3 に示す。1735 cm�� の強いFunctional group modessample A sample B3038 3034 3034 C-H stretching2966 2960 2962 CH3 stretching2928 2926 2928 CH2 asymmetric stretching2855 2853 2854 CH2 symmetric stretching1664 1664 1664 C=C stretching1449 1447 1449 CH2 deformation1376 1376 1376 CH3 deformation837 836 841 C-H bendingF. variegataWavenumber / cm-1 97 %  Cis-1,456 57溝部智也・留中佑真・仲宗根桂子 イオン液体を用いた天然ポリイソプレンの抽出実験吸収は C=O の存在を，また，3438 cm�� 付近の幅広い吸収帯は，OH の存在をそれぞれ示唆する。 さらに，1243 cm�� に，C(=O)－O による幅広い特性吸収が観測されたことから，脂肪酸のグリセリンエステルのジグリセリドが主成分であると推定された 12)。   Fig. 3.  IR spectrum of the acetone soluble materials from F. variegata.  2-2) NMR 分析 下図のように，イソプレンの各炭素原子に(1)～(5)と番号をつけて，以下の表に化学シフト値とその帰属を示した。   Fig. 4 に，ギランイヌビワの幹から抽出・精製されたゴム成分と 97% Cis-1,4 の 1H NMR スペクトルを示す。なお，7.26 ppm は重クロロホルム由来のシグナルである。また，Table 3 に両者のシグナルの化学シフト値を示した。これらの化学シフト値は一致した。 𝛿𝛿𝛿 1.68 のシグナルは，��𝛿� (5) によるもので，𝛿𝛿𝛿 5.12 のシグナルは，� �𝛿 � (3) によるものである。𝛿𝛿𝛿 2.04 のシグナルは，��𝛿� �(1) と��𝛿� �(4) とのシグナルであるが，何れのスペクトルを拡大しても分離せず，幅広い singlet として観測された。   Fig. 4.  1H NMR spectra of authentic 97% cis-1,4-polyisoprene (97% Cis-1,4, upper) and the rubber material from F. variegata: sample A (middle), sample B (lower).   Table 3.  1H NMR Chemical shifts of the rubber material from F. variegata and authentic 97% cis-1,4-polyisoprene (97% Cis-1,4).    次に，ギランイヌビワの幹から抽出・精製されたゴム成分と 97% Cis 1,4 の 13C NMR スペクトルをFig. 5 に示す。なお，77.0 ppm の鋭いシグナルは重クロロホルム由来のシグナルである。また，Table 4 に両者のシグナルの化学シフト値を示した。これらの化学シフト値は良い一致を示した。    Fig. 5.  13C NMR spectra of authentic 97% cis-1,4-polyisoprene (97% Cis-1,4, upper) and the rubber material from F. variegata: sample A (middle), sample B (lower).  proton 97% Cis-1,4sample A sample Bolefinic proton  (3) 5.12 (s) 5.12 (s) 5.12 (s)methylene proton  (1), (4) 2.04 (br. s) 2.04 (br. s) 2.04 (br. s)methyl proton  (5) 1.68 (s) 1.68 (s) 1.68 (s)1H NMR Chemical shift (ppm) in CDCl3F. variegatas and br. s mean singlet and broad singlet, respectively.58 59溝部智也・留中佑真・仲宗根桂子 イオン液体を用いた天然ポリイソプレンの抽出実験Table 4.  13C NMR Chemical shifts of the rubber material from F. variegata and authentic 97% cis-1,4-polyisoprene (97% Cis-1,4).    以上の結果から，ギランイヌビワの幹から抽出・精製されたゴム成分はシス-1,4-ポリイソプレンであることが分かった。 一方，脂質等の成分に対する NMR スペクトルから，遊離した高級脂肪酸の存在も示唆された。  2-3) CHN 分析 Table 5 に CHN 元素分析の結果を示す。イソプレンは分子式 C5H8と表せるので，炭素 C を 5molとして換算した値で示した。試料 A から得られたゴム成分に対して一回の測定を行った。試料質量は1.476 mg であった。   Table 5.  CHN element analysis of the rubber material from F. variegate.    C と H のモル比から，ポリイソプレンであることが確認できた。試料 A の調整濃度は約 30％と高かったが，ゴム成分の純度は良いという結果になった。なお，分析値に N が含まれているが，ギランイヌビワの幹から抽出・精製されたゴム成分に含まれるタンパク質の量は，市販品である 97％ Cis-1,4の CHN 分析結果との比較から，市販品と同程度の含有量であった。  考察  ギランイヌビワが産出するラテックス中には，僅か 0.05～0.11%程度であるが，シス型のポリイソプレンが含まれていることが明らかとなった。 天然ポリイソプレンを抽出できたことから，ラテックス中の主たるタンパク質等はイオン液体に溶解したものと思われる。イオン液体に対するタンパク質等の濃度を見積もると，溶液 A が 13 ％，溶液 Bが 17 ％となった。一方，イオン液体に不溶なポリイソプレンについては，溶液の面上でゲル状に凝集するので容易に分離することができた。 今回も純度の良いポリイソプレンが得られたので，この抽出・精製操作方法は有効であり，他の植物が産出するラテックスからゴム成分を精製する際にも，本操作方法が応用されることを期待している。特に，工業用原料として使用されていない植物のラッテクスはタンパク質を多く含むことが予想される。従って，イオン液体による前処理は最終的に高純度なポリイソプレンを得るために有益である。 今後の課題は，ゴム成分中のイソプレンの重合度を明らかにするためにゴム成分の平均分子量と分子量分布を調べること，また，ゴム成分中のポリイソプレン鎖の末端と末端の構造を解明するために，13C NMR スペクトルの詳細な検討（末端）とアセトンで脱脂したアセトン可溶物に含まれる脂質等の成分（末端）を調べること等が挙げられる。  結論  ギランイヌビワが産出するラテックスからゴム成分を抽出し，市販品程度の純度まで精製した。機器分析の結果から，シス型ポリイソプレンが，ラテックス中に約 0.1％含まれていることを明らかにした。 イオン液体を用いた新たな抽出法は，ゴム成分にcarbon atom 97% Cis-1,4sample A sample B(2) 135.21 135.21 135.22(3) 125.03 125.03 125.03(1) 32.21 32.21 32.21(4) 26.40 26.40 26.40(5) 23.43 23.43 23.4313C NMR Chemical shift (ppm) in CDCl3F. variegataH C Nmol mol molF. variegata , sample A 8.027 5 0.01997% Cis-1,4 8.083 5 0.015Sample58 59溝部智也・留中佑真・仲宗根桂子含まれるタンパク質等の除去に対し有効であることが分かった。  謝辞  分析機器を使用するにあたりご配慮を頂きました琉球大学研究基盤センターのスタッフに感謝します。 本論文の校閲にあたり，有益なご助言を頂いた理学部海洋自然科学科の荻原和仁教授に感謝致します。  引用文献  1） 沖縄植物野外活用図鑑，第６巻，山地の植物，多和田真淳（監修）・池原直樹（著者），新星図書出版（1984）．林野庁 九州森林管理局 西表森林生態系保全センター，    ；https://www.rinya.maff.go.jp/kyusyu/iriomote_fc/iriomote_syokubutusi/attach/pdf/syokubutusi_1-97.pdf 2） 田中康之，日本ゴム協会誌，55(10)，652 (1982)． 3） 河原成元，日本ゴム協会誌，91(5)，143 (2018)． 4） 田中康之・Eng Aik Hwee，高分子，46(11)，816 (1997)． 5） S. Yamashita, et al., eLife 5, e19022 (2016)． 6） 高橋征司・山下哲・伏原和久，高分子，66(6)，278 (2017)． 7） 河原成元・田中康之，日本ゴム協会誌，82(10)， 417 (2009)． 8） 田中康之，日本ゴム協会誌，74(12), 468 (2001)． 9） 仲宗根桂子・高田晃彦・高橋良彰・高野敦志，第63 回レオロジー討論会 講演要旨集，146 (2015)． 10） Yoshiaki Takahashi, Keiko Nakasone, Sou Satou, Hajime Ohtani, Atsushi Takano, Yushu Matsushita, The International Rubber Conference, Kitakyushu, Japan (2016)． 11） 仲宗根早海・志津貴大・仲宗根桂子，琉球大学理学部紀要，111, 45 (2022)． 12） S. Kawahara, T. Kakubo, J.T. Sakdapipanich, Y. Isono, Y. Tanaka, Polymer, 41, 7483 (2000)． 60

Extraction of Rubbery Material from the Stem of Ficus variegata  by use of Ionic Liquid

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