総合研究大学院大学博士（理学）application/pdf総研大甲第2423号thesi

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KANEKO, Shunya

カネコ, シュンヤ

金子, 隼也

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総合研究大学院大学博士（理学）application/pdf総研大甲第2423号doctoral thesi

SOKENDAI  Institutional Repository (Graduate University for Advanced Studies)

    R 氏 名 金子 隼也   学位（専攻分野） 博士（理学）  学 位 記 番 号 総研大甲第 2423 号   学位授与の日付  2023 年 3 月 24 日  学位授与の要件  生命科学研究科 遺伝学専攻   学位規則第６条第１項該当  学 位 論 文 題 目 Mettl1-dependent tRNA m7G modification controls tRNA expression and fertility in Drosophila melanogaster  論 文 審 査 委 員 主  査 酒井 則良 遺伝学専攻 准教授   佐藤 豊 遺伝学専攻 教授   平田 たつみ 遺伝学専攻 教授   岩里 琢治 遺伝学専攻 教授   鈴木 勉 東京大学 大学院工学系研究科 教授           （様式３） 博士論文の要旨  氏 名  Kaneko, Shunya  論文題目  Mettl1-dependent tRNA m7G modification controls tRNA expression and fertility in Drosophila melanogaster  The epitranscriptome is defined as the collection of biochemical modifications that occur on RNA transcripts. Extensive analysis of the epitranscriptome, which constitutes a key layers of gene regulation, has revealed more than 170 modifications, yet a complete picture of the functions of RNA modifications remains obscure. Methylation is the most frequently detected RNA modification, which is mediated by several families of methyltransferases. The methyltransferase-like (METTL) family comprises 35 genes in human. Some METTLs are linked to human diseases, indicating their importance; however, the overall significance of methylation mediated by METTLs is largely unknown.  In this thesis, I explored the functions of Mettl genes using Drosophila melanogaster as a model organism. Using the CRISPR/Cas9 system, I found that 7 of 21 Mettls are required for normal growth and fertility of D. melanogaster, indicating that the regulation of the epitranscriptome has a great impact on higher eukaryotes. From the Mettls I identified to be essential, I further investigated Mettl1. Mettl1 induces N7-methylguanosine (m7G) modification of RNAs. To reveal the role of Mettl1 in development, I generated Mettl1 knockout (Mettl1-KO) flies using the CRISPR-Cas9 system. The fertility of male and female Mettl1-KO flies was significantly decreased. The sterility of Mettl1-KO flies was rescued by a wild-type Mettl1 transgene, but not by a Mettl1 transgene containing a mutation that removed methylation activity, indicating the methyltransferase activity of Mettl1 to be critical for fertility. To characterize the role of Mettl1 in spermatogenesis, I analyzed Mettl1 expression patterns and determined which steps of spermatogenesis are impaired in Mettl1-KO flies. Several marker antibodies showed that Mettl1-KO spermatogenesis arrests at the spermatid elongation stage. Tissue specific expression of Mettl1 indicates that germ cell function of Mettl1 is critical for fertility, on the other hands, somatic niche cells appear to be intact in Mettl1-KO flies. These results indicate that Mettl1 plays a function in regulating a germ cell development in male spermatogenesis.  To reveal the molecular function of Mettl1, I searched for the RNA targets of m7G modification. Northern blot analyses identified a subset of tRNAs that possess Mettl1-dependent m7G modification in vivo. I also established an in vitro m7G methylation assay using recombinant Mettl1 protein and confirmed that tRNAs can be modified in vitro. TRM8, an ortholog of Mettl1 in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, forms a complex with TRM82, an S. cerevisiae ortholog of WD repeat protein 4 (WDR4), which acts as a non-catalytic subunit required for the m7G modification. I therefore studied the involvement of Wuho (Wh), a Drosophila WDR4 ortholog, in the m7G tRNA methylation and found that Wh is also required for m7G modification of tRNA. Moreover, I performed tRNA reduction and cleavage sequencing (TRAC-seq) analysis and identified 14 of 44 ovary tRNAs to be Mettl1 targets. To study how the loss of Mettl1 affects tRNAs, I measured tRNAs abundance. The amount of tRNA iMet-CAT, an m7G-modified tRNA, was decreased in male gonads, indicating that m7G modification is required for tRNA stability, as is observed in mammalian cultured cells and S. cerevisiae. In S. cerevisiae, loss of TRM8 makes tRNAs unstable because of degradation by exonucleases of the rapid tRNA decay (RTD) pathway. In addition, perturbation of the RTD pathway by ectopically expressed translational elongation factor EF-1α suppresses the TRM8-mutant phenotypes. I therefore conducted a similar assay in D. melanogaster. As expected, male fertility was partially rescued by the ectopic expression of eEF1α, which is a homolog of EF-1α in D. melanogaster, indicating that the stabilization of tRNAs by Mettl1-mediated m7G modification is required for the male fertility. Interestingly, the expression level of eEF1α in the testis was slightly lower than that in other tissues, which may explain why Mettl1 depletion specifically affects fertility but not functions of other tissues. Taking my findings together, I conclude that Mettl1-mediated control of tRNA stability is essential for Drosophila fertility and I propose a model of Mettl1 functions.   （様式８・別紙１）F o r m 8 ・ S e p a r a t e  S h e e t Results of the doctoral thesis defense 博士論文審査結果  氏 名N a m e  i n  F u l l 金子  隼也   論文題目T i t l e Mettl1-dependent tRNA m7G modification controls tRNA expression and      fertility in Drosophila melanogaster   転写産物である RNA は様々な生化学的修飾を受けることが知られている。メチル化は最も頻繁に検出される  RNA 修飾であり、それに関与するメチルトランスフェラーゼ様  (METTL) ファミリーはヒトでは  35 遺伝子が存在し、一部はヒトの遺伝子疾患に関連することが示されている。しかしながら、METTL によって媒介される RNA メチル化の生物的な意味については不明な点が多く残されている。  金子さんは、ショウジョウバエを材料に CRISPR/Cas9 システムを用いて Mettl ファミリー遺伝子 20 個の変異体を作出し、7 個で変異体の成長と生殖能力に異常が起きる事を示した。このうち、RNA の 7-メチルグアノシン  (m7G) 修飾を導入する  Mettl1 のノックアウト  (Mettl1-KO) では、オスもメスも生殖能力が大幅に低下していた。そして、その不稔性は野生型  Mettl1 トランスジーンによって救済できるが、メチル化活性のない変異型Mettl1 では救済できないことを明らかにした。さらに、Mettl1 が精巣で発現し精子形成に関与していること、生殖細胞特異的に Mettl1 を発現するトランスジーンで不稔性を救済できることを示し、Mettl1 が生殖細胞自律的に機能し、そのメチル化活性が精子形成に必要であると結論した。  次に、生殖能力における Mettl1 の分子機構を明らかにするために、Mettl1 による m7G修飾のターゲットとなる RNA の検索を進めた。出芽酵母では、METTL1 オルソログのTrm8 は、m7G 修飾に必要な非触媒サブユニット WDR4 オルソログの Trm82 と複合体を形成する。そこで、ショウジョウバエの WDR4 オルソログである Wuho (Wh)と Mettl1 がヘテロダイマーを形成することを調べ、この複合体が in vitro で tRNA の m7G 修飾を引き起こすことを示した。さらに、tRNA reduction and cleavage sequencing (TRAC-seq) 法を用いて、卵巣で発現する 44 個の tRNA のうち 14 個が Mettl1 のターゲットであることを特定した。精巣でも Mettl1 依存的に tRNA iMet-CAT の m7G 修飾が起こることを確認した。出芽酵母では、Rapid tRNA Decay pathway のエキソヌクレアーゼによる分解のために TRM8 変異体では tRNA が不安定になること、翻訳伸長因子 Tef1 が tRNA と結合して保護するため TEF1 の過剰発現が tRNA の分解を妨げることが報告されている。そこで、TEF1 のショウジョウバエホモログである eEF1αを過剰発現させて、Mettl1-KO の稔性が部分的に救済されることを示した。さらに、Mettl1 の欠損が生殖能力に特に影響を与え、他の組織の機能には影響を与えない理由として、精巣の eEF1αの発現レベルが他の組織よりもわずかに低いことを示した。これらの結果から、Mettl1 を介した tRNA の安定性の制御はショウジョウバエの生殖細胞の発達に不可欠であると結論付けた。  以上の金子さんの研究成果は、Mettl1 による tRNA のメチル化修飾がショウジョウバエの生殖細胞の発達に必要であるという重要な新規知見を与えるものであり、博士論文として質量ともに十分な内容を含んでいる。博士授与の水準を十分に満たしていると、審査員全員一致で判断した。   

Mettl1-dependent tRNA m7G modification controls tRNA expression and fertility in Drosophila melanogaster

https://ir.soken.ac.jp/record/6668/files/%E7%94%B22423.pdf

Mettl1-dependent tRNA m7G modification controls tRNA expression and fertility in Drosophila melanogaster

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