Nakatsu, Koki

中津, 幸輝

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Nagoya Repository

1 / 4 報告番号 甲 第   14908 号 主 論 文 の 要 旨 論文題目 Novel Strategies that Facilitate Peptide Ligation in Chemical Protein Synthesis (タンパク質化学合成法におけるペプチド連結反応を促進する新規戦略)氏  名 中津 幸輝 論 文 内 容 の 要 旨 Chapter 1 序論 近年、化学合成の技術によりタンパク質を調製する「タンパク質化学合成法」が盛んに研究されている。化学合成法では多様な非天然アミノ酸の導入が可能であり、遺伝子工学的手法では発現困難なタンパク質の合成が可能となる。ペプチド固相合成法では、合成可能な長さに制限があるため、化学合成法ではペプチド鎖同士を連結させることにより全長を合成する。このような連結反応の中でも、C 末端チオエステルと N 末端システインが選択的に縮合される Native Chemical Ligation(NCL)1が最も広く用いられている。 ゆえに、現在最も汎用的な Fmoc 固相合成法に適用可能かつ、望みのタイミングでチオエステルへと迅速に変換可能なチオエステル前駆体が開発されてきた。このチオエステル前駆体の過去研究を総括している。また、タンパク質化学合成では、連結するペプチド断片が多くなるほど反応ステップ数・精製回数が増え、合成に要する手間や時間の増加・合成収率の低下が問題となる。合成スキームを効率化する方法論として、精製を介さずに複数断片を連続で繋げる One-pot ペプチド連結法が開発さまざまに開発されてきた。特に NCL を用いた One-potペプチド連結の研究例について C-to-N（C 末端から N 末端）と N-to-C 方向（N 末端から C 末端）に分けてまとめている。 Chapter 2 【分子内水素結合により加速されるジケトピペラジン化反応を用いたタグ化ペプチドチオエステル合成】  2 / 4  Chapter 2-1 Cys-Pro-脱離基型のチオエステル前駆体は、システイン残基における NーS アシルシフトと 2, 5-ジケトピペラジン(DKP)形成の連続的な反応により高効率かつ分子内反応のみでチオエステル合成が可能となるという特徴をもつ。過去には川上先生らのグループによる Cys-Pro-ester2や、所属研究グループによる脱離基としてイミド構造を用いた Cys-Pro-Imide(CPI)などが開発されている。3,4 これら研究では脱離基の検討が多くなされていた一方で、Pro 残基における修飾が反応に与える影響は調べられてこなかった。また、Pro 残基にタグ配列を効率導入することができれば、タグ付きチオエステルの効率合成が可能となることに着目した。さまざまな修飾Pro 誘導体の中でも、4S-hydroxyproline や 4S-amideproline はプロリンのカルボニルと分子内水素結合を形成し、cis-trans 異性化やピロリジン環のパッカリングにも影響を与えることが分かっている。5,6 この水素ドナー型の修飾がDKPチオエステル形成反応効率に与える影響を、Cys-Pro(4S-X)-pyrazole 型のモデルペプチドを用いることで詳細に解析した。試した修飾プロリンの中でも、4S-hydroxy や 4S-oxalamide 型の修飾など、電子不足な水素ドナー修飾が特に高い反応効率を示すことが分かった (30~45 min)。その一方で、無修飾または 4S-OBn 型の修飾プロリンでは反応完了に 180 min 以上を要し、水素結合ドナーの重要性が示された。また、oxalamide 型のリンカーを介してポリリシン型の可溶化タグを固相合成で導入する手法を開発した。 さらに、この分子内水素結合による反応機構をさらに詳細に解析するために、Gaussian16 を用いたDFT計算を行った。計算では反応系を単純化し Proの周辺にフォーカスするためにAla-Pro(4S-X)-pyrazole(X=H, OH, OMe)をモデルとして用いた。DFT 計算の結果から、水素ドナーを有するOH 修飾では、endo パッカリングにおいて、DKP 形成反応の四面体中間体中のオキソアニオンと分子内水素結合を形成しながら遷移状態や反応中間体を安定化していることが分かった。 Chapter 2-2 4S-水素ドナー修飾に加え、非水素ドナー型の 4S-, 4R-修飾 Pro 誘導体についても同様の検討を行い、DKP チオエステル形成反応のさらなる反応機構解析を行った。試した修飾の中でも、Pro(4,4-F2)を用いた場合、DKP 形成反応が 20 min で完了するほどに大幅な加速が起こることが分かった。また、4R-位への電子求引型の修飾 (F, N3, triazole, OH, or OBn)を導入することでも無修飾 Proに比べてDKPチオエステル形成反応が加速されることが分かった(30~45 min)。一方、4S-位のおいて電子求引型の修飾(F, N3, triazole, or OBn)を行った場合は置換基が嵩高い場合(triazole)のみ反応加速が起こることが分かった(~60 min)。 この機構考察のため、Chapter 2-1 と同様に Ala-Pro(X)-pyrazole (X= 4,4-F2, 4S-F, 4R-F)をモデルとして用いた DFT 計算を行った。この結果より、4R-F 修飾では、gauche 効果により安定化されるピロリジン環の exoパッカリングがDKP形成反応において有利な配座であることが支持された。 3 / 4  これにより、4S-位における嵩高い置換基は、DKP 形成反応中の四面体中間体オキソアニオンとの立体反発によって gauche 効果を乗り越えて exo パッカリングが優先されることで、反応加速が起こることが示唆された。また、4,4-F2については、gauche 効果が打ち消されて endo-exo パッカリングがどちらも取れること、強力な電子求引基によって Pro アミド結合の異性化が加速されたことが DKP 形成反応の大幅な加速に関係してると考察された。 Chapter 3 【求核性を抑えた N末端チアゾリジンの脱保護剤開発による C-to-N One-pot連結手法】7  N末端チアゾリジン(Thz)は Cysの保護型前駆体として NCLを用いる複数ペプチド断片の連結に用いられてきた。8 一般的に Thz 脱保護においては弱酸性の pH~4 で methoxyamine が使用されることが多いが、one-pot ペプチド結合において methoxyamine はチオエステルと反応して不活性化し、連結反応を阻害することが知られている。この問題点を解決するために、チオエステルへの求核性を抑えた Thz 脱保護剤の設計・検討を行った。Thz 脱保護においては formaldehyde を捕捉することが重要であるということに着目し、2-aminobenzamide 型のアルデヒド捕捉剤の開発を行った。分子設計においては、（1）para-methoxy 基の導入によるアミンの求核性の調整すること、(2) hydrazide や hydroxamic acid など、α効果によって求核性が向上したアミドを用いることなどを考慮した。試した捕捉剤の中でも N’,N’-dimethylbenzohydrazide (AMDBH)が pH4.0 において高い Thz 脱保護効率を示した。さらに、AMDBH 存在下 pH7.0−7.5 においては Thz やチオエステルペプチドは高い安定性を有することを示した。さらに、AMDBH をもちいた Thz 脱保護方法を応用して、脱保護と NCL のそれぞれの過程で pH を上げ下げすることで 4 断片のペプチドを C-to-N で連結する手法を確立し、モノユビキチン化ヒストン H2A.Z の全合成を達成した(ligation yield 26%)。 Chapter 4 【アリル系新規チオール保護基を用いた連結方向可変型 One-pot 連結手法の開発】 One-pot ペプチド連結の手法はこれまでにもさまざまに開発されてきたが、今までの手法は、C末端チオエステル活性制御による N-to-C 方向(N 末端側から C 末端へ)連結、もしくは N 末端システイン活性制御による C-to-N 方向連結の 2 種類のうち片方向の連結のみに限定されている。これら連結方向を切り替えながらの one-pot ペプチド連結法も考えられるが、N-to-C と C-to-N の2 種類の直交的な one-pot 連結法の組み合わせが必要となるために開発は困難であり、今までに報告例は全くない。タンパク質化学合成においては、ペプチドの連結方向により合成の成否が左右される場合が多く、この未達成の one-pot 連結法である「連結方向切り替え可能な(Direction-Switchable) one-pot 連結法」開発の意義は大きい。  4 / 4  所属研究グループでは前章の N末端 Thz の AMDBH による脱保護と別に N 末端 Alloc の脱保護による脱保護法を開発しており、これらは直交的な反応系であることが予想されたがいずれも C-to-N連結にしか用いることができない。そこで、新規 allyl 系システイン保護基である TfeAllocam [N-(2,2,2-trifluoroethyl) allyloxycarbonylaminomethyl]基を設計・合成し、その Fmoc-SPPS における適用可能性と金属錯体(Pd 錯体,9 Ru 錯体 10)による脱保護条件を検討した。TfeAllocam は Fmoc-SPPS の全ての条件及びNCL 条件おいて安定であることを示した。また脱保護においては、金属錯体による Alloc 脱保護後に発生する formaldehyde を AMDBH によって捕捉しながら脱保護することが可能であることが分かった。これら結果より、チオエステル前駆体 Hnb-Cys11 を組み合わせた、Hnb-Cys(TfeAllocam)により C 末端チオエステルの活性制御による N-to-C 方向連結と前章の Thz 脱保護による C-to-N 連結の組み合わせにより連結方向切り替え可能な one-pot 連結法が可能であると考えた。そこで、ジユビキチン化ヒストン H3 の化学合成においてこのコンセプトを適用し、高効率で化学合成を達成した (ligation yield 23%, total yield 13%)。 (1)  Dawson, P. E.; Muir, T. W.; Clark-Lewis, I.; Kent, S. B. Science 1994, 266, 776–779. (2)  Kawakami, T.; Aimoto, S. Chem. Lett. 2007, 36, 76–77. (3)  Yanase, M.; Nakatsu, K.; Cardos, C. J.; Konda, Y.; Hayashi, G.; Okamoto, A. Chem. Sci. 2019, 10, 5967–5975. (4)  Nakatsu, K.; Yanase, M.; Hayashi, G.; Okamoto, A. Org. Lett. 2020, 22, 4670–4674. (5)  Shoulders, M. D.; Kotch, F. W.; Choudhary, A.; Guzei, I. A.; Raines, R. T. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 10857–10865. (6)  Kuemin, M.; Nagel, Y. A.; Schweizer, S.; Monnard, F. W.; Ochsenfeld, C.; Wennemers, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6324–6327. (7)  Nakatsu, K.; Okamoto, A.; Hayashi, G.; Murakami, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202206240. (8)  Bang, D.; Kent, S. B. H. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 2534–2538. (9)  Kamo, N.; Hayashi, G.; Okamoto, A. Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 1540. (10) Kamo, N.; Kujirai, T.; Kurumizaka, H.; Murakami, H.; Hayashi, G.; Okamoto, A. Chem. Sci. 2021, 12, 5926–5937. (11) Terrier, V. P.; Adihou, H.; Arnould, M.; Delmas, A. F.; Aucagne, V. Chem. Sci. 2016, 7, 339–345. 

Novel Strategies that Facilitate Peptide Ligation in Chemical Protein Synthesis

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