Metodología para obtener muestras de fitoplancton para posterior extracción, caracterización y cuantificación de Aldehídos volátiles insaturados

Arandia, N.

Bartual Magro, Ana

González Gordillo, Juan Ignacio

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Repositorio de Objetos de Docencia e Investigación de la Universidad de Cádiz

Muestreo de fitoplancton para extracción de PUAs (aldehídos volátiles poliinsaturados) Arandia, N.; González-Gordillo, J. I.; Bartual, A.CACYTMAR, Universidad de CádizFinalidad. Campo de aplicaciónMetodología para obtener muestras de fitoplancton para posterior ex-tracción, caracterización y cuantificación de Aldehídos volátiles insaturados.Conceptos generalesLas diatomeas constituyen un grupo fundamental en las cadenas trófi-cas marinas tradicionalmente explotadas, protagonizando grandes prolife-raciones o blooms en una escala espaciotemporal previsible y asociada aun aumento en la disponibilidad de nutrientes. Durante la última década,numerosos trabajos se han centrado en el estudio de un tipo de compuestode carácter alelopático liberado por diatomeas. Se trata de aldehídos voláti-les poliinsaturados (PUA), eminentemente decadienal y octadienal, queson liberados ante la presión de herbivoría, y por tanto tras un daño celu-lar. De ahí, que una de las funciones atribuidas a este tipo de compuestossea defensiva, por su toxicidad para el zooplancton consumidor, principal-mente copépodos. Este hecho constituye hoy día un punto de discusiónimportante, especialmente cuando se trata de evaluar las implicaciones tró-ficas así como el significado ecológico de estas sustancias. Un segundo pa-pel que se ha atribuído a estas sustancias es de señal infoquímica intercelu-lar, pudiendo actuar como reguladoras en la sucesión y colapso de unbloom. Poco se sabe, sin embargo, del efecto que las condiciones ambien-tales, muy cambiantes en el desarrollo de un bloom, puedan tener en el673Malaspina 3-6_Malaspina  27/03/12  11:27  Página 673proceso de síntesis de precursores de estos PUA, e incluso, se desconoce sipueden inducir o regular de algún modo su liberación. No se pueden des-cartar, además, otros efectos de interés ecológico, como la ventaja competi-tiva de las especies productoras frente a las no productoras ante el ataquede un consumidor. Además, prácticamente no se conoce qué cantidad deestos PUAs existen en el medio natural, tanto en episodios de bloom comoen entornos propicios para las diatomeas. Equipamiento necesarioTermosalinómetro continuo del barco.Descripción de la técnicaToma de muestras1. Medir el flujo (l/min) del termosalinómetro continuo del barco yapuntarlo en el estadillo.2. Al llegar al punto de muestreo (apuntar fecha, hora y estación concoordenadas en el estadillo) filtrar un volumen mínimo de 50 l pormallas consecutivas de 200 micras y 10 micras.3. Apuntar en el estadillo tiempo de filtrado del continuo sobre mallade 10 micras (nos permitirá deducir el volumen total empleado). 4. Concentrar el fitoplancton acumulado en la malla de 10 micras enun vaso de precipitados. 5. Filtrar el contenido del vaso sobre filtro poretics de 0.4 micras.6. Lavar el filtro sobre vial de vidrio etiquetado con 1 ml de DERIVA-TIZANTE (0 - (2, 3, 4, 5, 6, - Pentafluorobencil) hidroxilamina(PFBHA-HCl) en 100 nM de Tris-HCl a pH: 7.0) usando pipeta au-tomática y punta azul. El filtro puede colocarse en la pared verticaldel tubo y verter el derivatizante sobre este, de forma que la solu-ción vaya arrastrando las células de fitoplancton del filtro. Si seusaran varios filtros para la misma muestra porque estuviera muyconcentrada y tardara mucho en filtrar, tener la precaución de la-var el segundo, tercer… filtro con el mismo ml de reactivo y sobreel mismo vial en el que se lavó el primer l filtro. El volumen finalde cada muestra en el vial debe ser SIEMPRE de 1 ml .7. Congelar inmediatamente la muestra.8. Repetir todo el proceso con una segunda una segunda réplica.9. Volver a medir el flujo del continuo y apuntar en estadillo.10. Lavar todo el material con agua filtrada o, preferiblemente, conagua dulce.LIBRO BLANCO DE MÉTODOS Y TÉCNICAS DE TRABAJO OCEANOGRÁFICO674Malaspina 3-6_Malaspina  27/03/12  11:27  Página 674Estadillo de datosCuadro sinóptico de la técnicaReactivos y material de laboratorioConservantes:– DISOLUCION 25 mM de o-(2,3,4,5,6,-Pentafluorobencil) hidroxila-mina (PFBHA-HCl) en 100 mM de Tris-HCl a pH: 7.0. – Mallas de 200 micras y 10 micras.– 2 Columnas de filtración (de 25 mm).DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DEL ZOOPLANCTON EN EL OCÉANO 675MUESTRAS PUAPROYECTO ……FLUJO DEL CONTINUO:FECHAHORAGMTESTACION PROF.MALLA ZPUSADAMALLAFITOVOLUMEN CONCENTRADO(TIEMPO DEL CONTINUO)NºVIALPUAFecha y hora L/min.Malaspina 3-6_Malaspina  27/03/12  11:27  Página 675– 2 Vasos de precipitados. – 1 Timer.– 100 Filtros de policarbonato poretics 0.4 micras-25 mm.– 1 Pinza Millipore. – DERIVATIZANTE en bote de topacio.– Viales de vidrio para almacenamiento de muestras.Cálculo de los resultadosEl cálculo del volumen concentrado se obtendría simplemente multipli-cando el tiempo de filtrado del continuo por el flujo medio del continuo.ReferenciasWICHARD, T., S. POULET, G. POHNERT. 2005. «Determination and quantificationof a,b,d,g.unsaturated aldehydes as pentafluorobenzyl-oxime derivatesin diatom cultures and natural phytoplankton populations: applicationin marine field studies». J. Chromatogr. B 814: 155-161.LIBRO BLANCO DE MÉTODOS Y TÉCNICAS DE TRABAJO OCEANOGRÁFICO676Malaspina 3-6_Malaspina  27/03/12  11:27  Página 676

Muestreo de fitoplancton para extracción de PUA (Aldehídos Volatiles Poliinsaturados)

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