Gascón Muñoz, Santiago

Herrero Espílez, Emérita Pilar

Moreno, F.

Repositorio Institucional de la Universidad de Oviedo

ENZIMAS RESPONSABLES DE LA FOSFORILACION DE LA GLUCOSA EN Saccharomyces carlsbergensis Por P. HERRERO, F. MORENO Y S. GASCON Depnriamenio In~erfnculta~ivo de Bioquimica Universidad d e  Oviedo. INTRODUCCION Desde que se  describió la existencia d e  la hexoquinasa (ATP: D- hexosa-6-fosfotransferasa, EC 2.7.1.1.) (1, 2) y la  glucoquinasa (ATP: D- glucosa-6-fosfotransferasa, EC 2.7.1.2.) (3, 4) en'Saccharomyces cerevisiae, las propiedades cinéticas de estos enzimas s e  han estudiado extensivamente (5, 6, 7). Asi mismo ha recibido una gran atención la regulación d e  su síntesis, aunque BIAZON y col. (8) describieron la naturaleza constitutiva de  estos enzimas en Rhodotorula glutinis, s e  conoce muy poco acerca d e  la regulación de  los niveles de estos enzimas en levaduras. En el hígado s e  describió que  glucoquinasa era un enzima inducible con propiedades cinéticas diferentes a las de  la hexoquinasa (6). Nosotros hemos realizado un estudio d e  las actividades capaces de  fosfori- lar la glucosa en Saccharomyces carlsbergensis, en  varios sentidos diferentes, por un lado s e  ha estudiado la variación de  la actividad fosforiladora de  la glucosa con el tiempo d e  cultivo y con diferentes fuentes d e  carbono, e n  otro sentido hemos identificado mediante criterios d e  filtración a través d e  geles d e  cambio iónico y exclusión molecular la existencia de  al menos tres formas enzimáticas con activi- dad fosforiladora d e  glucosa, procediendo al estudio d e  algunas d e  las propieda- des cinéticas de  cada una d e  estas actividades, habiendo encontrado diferencias entre ellas en cuanto a la afinidad por la glucosa y también en cuanto a estabili- dad. En el trabajo precedente, se  describe el efecto de  la D-xilosa en la síntesis de la invertasa de levaduras y se  relaciona éste, con el posible papel inhibidor del azúcar sobre la hexoquinasa. En este trabajo describimos el efecto d e  la D-xilosa y la D-lixosa sobre la hexoquinasa parcialmente purificada a partir de Saccharo- myces carlsbergensis. MATERIALES Y METODOS Reactivos S e  han obtenido de  Sigma Chemical Co. los siguientes productos: Glucosa oxidasa tipo V; peroxidasa tipo 111; o-dianisidina; adenosina 5' trifosfato y ácido etilendianino tetracetico (EDTA). De Pharmacia se  obtuvo el Sephadex G-100 y la Dietil aminoetil celulosa. De Difco, el extracto de  levadura y de Merck la glucosa, la xilosa, la lixosa y la galactosa. Microorganismo y su c i~l t ivo  Hemos utilizado en este trabajo la cepa de  levadura Saccharomyces carls- bergensis G 5 1 7  (C.E.C.T. n.O 1.317) descrito por GILLILAND (9).Las células se crecieron en un  agitador rotacional a 28OC en matraces de 500 m1 conteniendo 100 m1 de medio con 1 % de  extracto de  levadura y 1 % de glucosa. Después de 16 horas, las células se  recogieron y lavaron dos veces con extracto de levadura al 1 % por centrifugación a 4000xg durante 10 min. Los extractos libres de  células s e  obtuvieron por rotura mecánica con polvo de vidrio Ballotini suministrado por H. Mickle. Laboratory, Surrey (Inglaterra) con un diámetro medio de  0,4 mm. La proporción óptima de Ballotini con respecto a la suspensión celular ha sido descrita como del 50 % (vlv) (10). El conjunto s e  somete a una vibración circular de 4.000 rpm durante 1 rnin., asegurándonos de  esta forma un 100 % de  células rotas. El sistema no sufre calentamiento debido a la refrigeración proporcionada por una botella de nieve carbónica. Los extractos celulares se  obtienen por centrifugación a 18.000xg durante 25 min. Toluenización de  las levaduras S e  tomaron 0,5 m1 de cultivo a los tiempos que se especifican en los diferentes experimentos, añadiendo 0,3 m1 de  agua destilada y 0,025 m1 de  una mezcla que contenía tolueno, etanol y triton X-100 al 20 % en proporciones 1 : 4 : 1. Esta mezcla se  agita durante un minuto añadiéndose a continuación 5 rnl de  tampón fosfato potásico 50 mM pH 6,8, separándose a continuación las células por centrifugación a 4.000xg durante 10 min. y resuspendiéndose el precipitado celular en 0 ,s  m1 del mismo tampón. Ensayo de la hexoq~~inasa  La hexoquinasa se  determinó d e  acuerdo con el método descrito por A. SOLS y col. (11). Una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que ll,ul,J.iza 1 pmol de sustrato en un min. a 30°C en 0 , l  M de Tris-C1H pH 8,O conteniendo 0,008 M de  C1,Mg y 0,008 M de  ATP utilizando como sustrato giucosa 0,002 M. RESULTADOS Prod~t.cción del enzima La Fig. 1 resume los resultados obtenidos acerca de  la síntesis de la actividad fosforiladora de la glucosa cuando las levaduras utilizan glucosa o galactosa como fuentes de  carbono. En ambos casos el enzima s e  sintetiza a una velocidad idéntica a la con que se produce el crecimiento celular, deteniéndose la síntesis cuando s e  detiene el crecimiento, para posteriormente cuando las levadu- ras comienzan a utilizar el etanol producido en la fermentación de  los azúcares reanudar la síntesis de  esta actividad. Estos resultados nos conducen a la conclu- si6n de que tanto hexoquinasa como glucoquinasa de  Saccharornyces carlsbergen- sis son enzimas constitutivos, no encontrándose indicios de un carácter inducible de la glucoquinasa como el descrito anteriormente (6) para el enzima hepático. Tiempo (h) Tiempo (h) Fig. 1.+roducción de hexoquinusa por Saccharornyces carlsbergensis. Las células se crecieron en un medio constituido por un 1 9% de extracto de levadura y un 0,s % de glucosa (A) o un 1 % d e  gaiactosa (B). A los tiempos señalados en la figura, s e  tomaron muestras d e  los cultivos de 3 ml y después de centrifugadas las células a 4.000 x g durante 10 min. se lavaron dos veces con agua destilada y se resuspendieron en tampón fosfato 0,05 M, pH 7,O a un volumen final d e  3 ml. En dichas muestras s e  determinó la absorci6n a 600 nm y s e  procedió a toluenizar, según s e  describió en Materiales y Métodos, alicuolas de 100 pl para ensayar las actividades fosforiladoras de la glucosa ain situ. (o-.) actividad hexoquinasa; (-0) absorción. Isoenzimas de la actividad fosforiladora de la glr~cosa a) Cromatografía en DEAE-celulosa. Células de  S. carlsbergensis 1.317 s e  incubaron en 1 % de extracto de levadura y 1 % de glucosa, como fuente de  carbono durante 16 horas, a partir de  estas células s e  obtuvo un extracto según se describió en Materiales y Métodos, dicho extracto fue sometido a precipitación con sulfato amónico al 60 % de saturación durante 16 h. a 4OC. El precipitado se  recogió por centrifugación a 18.000xg durante 30 min. F r a c c i ó n  (No; Fig. 2.-Diferencias en l a  carga neta de las actividades fos/oriladoras de l a  glitcosa. Células de Saccharomyces carlsbergensis s e  crecieron durante 16 h. en un medio consti- tuido por extracto d e  levadura al 1 % y glucosa al 1 %. A partir d e  dichas células se  ohtuvo un extracto, rl  cual se  sometió durante 16 h. a una concentración de (NH,), SO, del 60 % de saturación. Obteniéndose un sobrenadante y un precipitado por centrifugacicin a 18.000 x y durante 30 min. El precipitado s e  resuspendió en tampón fosfato 0,05 M pH 7,O y tanto t.1 precipitado como el sobrenadante s e  dializó durante 16 h .  frente a tampón fusfato 0,05 M pI-1 7,O. La cromatografía del precipitado d e  (NH,), SO, en DEAE-celulosa (A) da lugar a la diferenciación d e  dos proteínas con diferente carga y la crornatografía del sobrrnadante d? la precipitación con (NH,), SO, en DEAE-celulosa (B) da lugar a la separación de una te]-cera actividad fosforiladora d e  glucosa. (e-e) actividad hexoquinasa; (x-x) rnolaridad dpl gra- diente lineal de NaCI. Teniendo las fracciones un volumen d e  5 ml. En la Fig. 2 A están representados los resultados obtenidos cuando croma- tografiamos en DEAE celulosa el precipitado d e  SO, (NH,),. S e  utilizó una columna de  20 cm d e  longitud y 2 cm d e  diámetro equilibrada con tampón fosfato 0,05 M pH 7,O. El volumen de  la muestra introducida en la columna fue de  39 m1 con una actividad d e  10 Ulml, a continuación s e  conectó un gradiente lineal de NaCl hasta 1 M. En dicha figura representamos los picos de  actividad fosforila- dora de  glucosa eluidos a diferentes concentraciones de  CINa. A una concentra- rihn de NnCI d e  0,12 M podemos observar cómo s e  libera un primer pico d e  actividad para más tarde a 0,16 M aparecer otro máximo de  actividad. En la Fig. 2 B están representados los resultados obtenidos cuando croma- iografiamos en DEAE celulosa el sobrenadante de  la precipitación con sulfato ainúnico al 60 % d e  saturación. La columna cromatográfica fue d e  iguales carac- terísticas que en  el caso anterior, siendo el volumen d e  muestra eluido 139 m1 que contenía 1,O Ulml, así mismo s e  conectó un gradiente lineal de  NaCl hasta 1 M. En este caso se  eluye un solo máximo d e  actividad el cual muestra su mixirno a una molaridad de 0,25 M máximo que no corresponde con los encontra- dos en el precipitado de  SO, (NH,), y que parece indicar que es una forma diferente a las representadas en la Fig. 2 A.  Filtración en Sephadex C-100 Los máximos d e  actividad fosforiladora d e  glucosa separados por cromato- grafía en DEAE-celulosa, s e  filtraron, después de concentrar, a través d e  Sepha- Jtlx G100  con el fin de  observar si existían entre ellos diferencias en peso molecular al igual que poseían diferentes cargas netas dichas proteínas enzimáti- cas. La columna utilizada tenía unas dimensiones d e  2 cm d e  diámetro y una longitud d e  85 cm de longitud. Como eluyente s e  utilizó tampón fosfato 0,05 M pH 7,O. El volumen muerto de  la columna s e  determinó mediante la cromatografía de Azul Dextrano recogiéndose fracciones d e  5 m1 y leyendo su absorción a 600 nm. 3.-Dijerencias en peso molecular de las actividades fosforiladoras de l a  glucosa. Las fracciones 17 a 22 de la Fig. 2 A s e  recogieron y concentraron, filtrándose 182 U a través d e  una columna d e  Sephadex G-100 (A). Las fracciones 38 a 43 de la Fig. 2B s e  recogieron y concentraron, filtrándose 91 U a través d e  una columna de Sephadex G100(B). En el primer caso (Fig. 3 A), las fracciones correspondientes a los n . O  17 a 22 s e  concentraron con «Aquacide 1-A» durante 16 h. La  filtración de 13 m1 de muestra que contenían 14 Ulml s e  nos resuelve en dos máximos d e  actividad hexoquinasa con VelVo d e  1,14 y 1,41; máximos que hemos llamado hexoquinasa 1 y 11 y que posteriormente hemos caracterizado cinéticamente. La Fig. 3 B nos presenta el cromatograma de la forma que s e  eluía a una concentración d e  NaCl d e  0,25 M. Las características de  la columna utilizada, fueron iguales a las descritas anteriormente. El volumen de  muestra que se  cromatografió fue de  7 m1 con una actividad d e  13 Ulml. El cromatograma como se  observa en la Fig. 3 B s e  nos resuelve en un solo máximo cuyo VelVo es de  1,41, volumen que coincide con la forma que denomi- namos hexoquinasa 11 pero que, como posteriormente se describe, presenta diferencias con la hexoquinasa 11 en estabilidad al pH y afinidad por el sustrato por lo que  nosotros denominamos hexoquinasa 111. Estabilidad a diferentes pH y aJinidad por la glucosa de la hexoquinasa, 1, I I  y III La Fig. 4 muestra que hexoquinasa 11 es estable en  un rango de pH 6-8,s inactivándose rápidamente cuando el pH baja d e  5,5 ó sube de  8,5. En el caso de  la hexoquinasa 111 el enzima es estable en un rango de pH 8-9 por debajo d e  8 y por enzima de  9 la actividad desciende rápidamente. Estas apreciables diferencias entre hexoquinasa II y 111, representan uno de los crite- rios utilizados para diferenciar ambas a pesar d e  poseer volúmenes relativos de elución en Sephadex G 1 0 0  iguales. y Fil. 4.-L.riibiii<iari úe Los actiuici~c<ks hexo- quirlasas il y iil a diferentes pH.  - 20 pl de hexoquinasa 11 o I I I ,  par- J/ I I I I I I  cialmente purificadas fueron tratadas con 50 pl de un tampón universal com- puesto por ácido malricv, ácido acPtico concentrado y Tris-liitlrnximetil-amini, metano a diferentes pH, ditrante 15 min. La actividad residual lue esti- mada por el niétodo (le lo glucosa oxi- 3 4 5 6 7 8 9 1 0  dasa. ( t e )  hexoquinasa 11; (PO) he- PH xoquinasa 111. La Tabla 1 muestra los valores d e  Km obtenidos para las tres formas d e  Iie-ioquinasa encontradas. El sustrato empleado en este estudio ha sido glucosa y los datos se  han calculado a partir de  las representaciones de  Lineweaver-Burk. TABLA 1 Enzima Sustrato Km (mM) Hexoquinasa I Glucosa 0 3  Ilrxoquinasa 11 Glucosa 0-5 Hexoquinasa 111 Glucosa 0 2  Efecto de la D-xilosa sobre la actividad hexoquinasa En la Fig. 5 se  pueden observar los efectos producidos sobre la actividad de la hexoquinasa en presencia de  diferentes concentraciones d e  D-xilosa. Una concentración d e  D-xilosa en la mezcla de  reacción cien veces superior a la concentración de  sustrato proporciona un 50 % de inhibición d e  la actividad enzirnática. Teniendo en cuenta que  la D-xilosa es un azúcar no metabolizable por las levaduras y que se  transporta rápidamente al interior de  las célvlas (12) estas concentraciones s e  alcanzan muy rápidamente «in vivo» cuando s e  adiciona al medio de  cultivo la D-xilosa, pudiendo como se  apunta en el trabajo precedente ocasionar un descenso en los niveles intracelulares de  la glucosa-6-fosfato u otros nietabolitos de la glucosa. Fig. 5.-Efecto de bn D-xilosa sobre lo activi- dad he~oqiiinlrsu. 20 pl de  hexoquinasa 11 o L I I ,  par- cialmente purificadas, s e  ensayaron según el método descrito anterior- mente en presencia d e  cantidades de  D-xilosa en el rango d e  O a 0,3 M. Dándose el valor de 100 % al ensayo que carecía d e  D-xilosa. De los resultados obtenidos en la purificación parcial, de  las actividades responsables de  la fosforilación de  la glucosa en Saccharomyces carlsbergensis s e  puede establecer que al menos existen dos isoenzimas de hexoquinasa conside- rando que la tercera forma es la glucoquinasa. Estas tres actividades ha sido posible identificarlas por diferencias en la carga neta de  las proteínas y aunque por criterios de  peso molecular se  muestran dos de ellas no separables (hexoqui- nasa 11 y 111), estas se  pueden diferenciar por su estabilidad al pH y por su afinidad por el sustrato. Las actividades responsables de  la fosforilación de la glucosa se muestran sensibles a la presencia de  D-xilosa en la mezcla d e  reacción (Fig. 5) actuando la D-xilosa como un inhibidor competitivo (13). REFERENCIAS (1) LAZARUS, N. R., RAMEL, A. M., RUSTUN, Y. M. y BARNARD, E. A. (1%6).-Biochemistry, 5, 4.003-4.016. (2) SCHULZE, 1. T. \, I:OI O\\ I  h \ .  1 '  I IOO'li. 1 1 1 1 t b 1 .  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Enzimas responsables de la fosforilación de la glucosa en Saccharomyces carlsbergensis

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