【目的】研究右美托咪定对巨噬细胞吞噬功能的影响并探讨其可能的机制。【方法】RAW264.7细胞分成对照组（control）、右美托咪定组（DEX）、BRL44408+右美托咪定组（BRL44408+DEX）。Western blotting检测α2A肾上腺素受体、p-Akt、Akt的表达，Phagocytosis

Assay Kit（IgG PE）检测巨噬细胞的吞噬能力。【结果】RAW264.7细胞上有α2A肾上腺素受体的表达；右美托咪定能够增强巨噬细胞的吞噬能力（P<0.001），BRL44408逆转巨噬细胞吞噬能力的增强（P<0.001）；右美托咪定使RAW264.7细胞的Akt通路激活，BRL44408的使用抑制Akt通路的激活（P<0.01）。【结论】右美托咪定可能通过α2A肾上腺素受体激活Akt通路，进而增强巨噬细胞的吞噬功能

吴珊

姚伟锋

罗刚健

蔡珺

黑子清

Directory of Open Access Journals

巨噬细胞是体内一群具有吞噬能力的细胞，在机体内参与机体的固有免疫和细胞免疫，它们主要的功能是对机体细胞残片和病原体进行吞噬及消化，并激活淋巴细胞和其他免疫细胞，对病原体做出反应，因此，巨噬细胞的吞噬功能是巨噬细胞发挥免疫作用的一种重要方式［1］。一系列的临床和基础实验［2-3］表明，巨噬细胞与动脉粥样硬化、肿瘤发生发展、器官缺血再灌注损伤、脓毒血症等疾病密切相关，其机制涉及TLR4/NFκB通路、p38 MAPK通路、Akt/mTOR通路等的激活或抑制。右旋美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是高选择性α2肾上腺素受体激动剂，具有镇静、镇痛、抗交右美托咪定受体依赖性增强巨噬细胞吞噬功能吴 珊，罗刚健，姚伟锋，蔡 珺，黑子清（中山大学附属第三医院麻醉科，广东 广州 510630）摘 要：【目的】研究右美托咪定对巨噬细胞吞噬功能的影响并探讨其可能的机制。【方法】RAW264.7细胞分成对照组（control）、右美托咪定组（DEX）、BRL44408+右美托咪定组（BRL44408+DEX）。Western blotting检测α2A 肾上腺素受体、p-Akt、Akt 的表达，Phagocytosis Assay Kit（IgG PE）检测巨噬细胞的吞噬能力。【结果】RAW264.7细胞上有α2A肾上腺素受体的表达；右美托咪定能够增强巨噬细胞的吞噬能力（P < 0.001），BRL44408逆转巨噬细胞吞噬能力的增强（P < 0.001）；右美托咪定使RAW264.7细胞的Akt通路激活，BRL44408的使用抑制Akt通路的激活（P < 0.01）。【结论】右美托咪定可能通过α2A肾上腺素受体激活Akt通路，进而增强巨噬细胞的吞噬功能。关键词：右美托咪定；巨噬细胞；吞噬功能；Akt通路中图分类号：R34 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2020）02-0268-05Dexmedetomidine Receptor Dependently Enhanced Macrophage PhagocytosisWU Shan，LUO Gang-jian，YAO Wei-feng，CAI Jun，HEI Zi-qing（Department of Anesthesiology，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China）Correspondence to：HEI Zi-qing；E-mail：heiziqing@hotmail.comAbstract：【Objective】To investigate the effect of dexmedetomidine on the phagocytosis of macrophages.【Methods】RAW264.7 cells were divided into control group，DEX group，and BRL44408+DEX group. Expression of α2A adrenergicreceptor，p-Akt and Akt were detected by Western Blotting；Phagocytosis Assay Kit（IgG PE）was used to measure thephagocytosis of macrophages.【Results】α2A adrenergic receptor was detected in RAW264.7 cells；Dexmedetomidinecould enhance the phagocytosis of macrophages（P < 0.001），and BRL44408 reversed the enhancement of phagocyticability of macrophages（P < 0.001）；Dexmedetomidine upregulated the expression of Akt in RAW264.7 cells，while theuse of BRL44408 inhibited the activation of the Akt pathway（P < 0.01）.【Conclusion】Dexmedetomidine could enhancephagocytosis of RAW264.7 by activating the Akt pathway through the α2A adrenergic receptor.Key words：dexmedetomidine；macrophage；phagocytosis；Akt pathway［J SUN Yat⁃sen Univ（Med Sci），2020，41（2）：268-272］收稿日期：2019-09-22基金项目：国家自然科学基金（81770649）作者简介：吴珊，博士研究生，研究方向：缺血再灌注损伤，围术期器官保护，E-mail：wushan3@mail2.sysu.edu.cn; 黑子清，通信作者，研究方向：缺血再灌注损伤，围术期器官保护，E-mail：heiziqing@hotmail.com第 41卷 第2期2020年 3月中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YAT⁃SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）Vol.41 No.2March 2020·临床研究·第2期感等作用，目前主要应用于 ICU 镇静和临床麻醉。现已发现α2A、α2B、α2C 3种α2-AR亚型，且认为DEX的药理作用主要经由α2A亚型介导。近年来，临床研究显示其还具有稳定血流动力学的作用，对围术期器官功能有潜在的保护效应。基础实验表明DEX可通过抗交感、抑制细胞凋亡、抑制氧化应激及炎性反应等多种途径对机体重要脏器（脑、心、肾、肺、肝脏与小肠等）等发挥保护作用［4-6］。DEX能够减轻脓毒症大鼠肝窦淤血扩张与肝门部炎性反应，推测与DEX抑制单核-巨噬细胞系统产生的细胞因子释放有关［7］。但目前DEX是否通过增加巨噬细胞的吞噬功能而产生器官保护作用的目前尚未见文献报道。我们通过免疫印迹实验确定了RAW264.7细胞中含有α2A肾上腺素受体，使用 DEX 及α2A肾上腺素受体抑制剂BRL44408，观察RAW264.7细胞的吞噬功能，并探讨可能的机制。1 材料与方法1.1 一般材料1.1.1 药 品 右美托咪定购于江苏恒瑞医药有限公司（批号：中国江苏连云港）。1.1.2 主要试剂及器材 BRL44408 购于 Sigma-Aldrish（货号：B4559）；LPS 购于 Sigma-Aldrish（货号：L2630）；α2A肾上腺素受体抗体购自武汉abclonal生物技术公司（货号：A2809）；p-Akt抗体购自 CST公司（货号：4060）、Akt抗体购自 CST公司（货号：9272），兔二抗购自 thermo生物技术公司（货号：G-21234）；Phagocytosis Assay Kit（IgG PE）购自 cayman生物技术公司（货号：600540）；昱圣化学发光液；Thermo荧光显微镜；BD流式细胞仪；天能 5200化学发光仪。1.1.3 细 胞 RAW264.7小鼠单核巨噬细胞购于广州速聚生物技术公司。1.2 方 法1.2.1 细胞处理 RAW264.7细胞以 3×105/mL的密度种于 12孔板中，细胞培养箱中培养 12 h，待贴壁后，DEX组将使用含 1 nmol/L DEX的培养基处理 1 h，BRL44408+DEX 组将在 DEX 前使用含1 ng/mL BRL44408的培养基处理 30 min。1.2.2 吞噬荧光颗粒 经 1.2.1处理的细胞使用PBS清洗3次，以1∶500浓度的含Phagocytosis AssayKit（IgG PE）的培养基处理细胞，置于 37 ℃孵育2 h，PBS清洗 3次，置于荧光显微镜下观察拍照。1.2.3 细胞吞噬率 经 1.2.1处理的细胞使用PBS清洗 3次，以 1∶500浓度的含Phagocytosis Assay Kit（IgG PE）的培养基处理细胞，置于 37 ℃孵育 2 h，PBS清洗 3次，每孔加入 PBS 1 mL，轻柔将细胞吹下，4 ℃，1 000 r/min，5 min，离心（r=9.5 cm），弃上清，用 300 μL PBS重悬后进行流式检查。1.2.4 Western Blotting 将 RAW264.7 细胞以 2×105/mL 的密度种于 6 孔板中，待细胞贴壁后，使用预冷 LPS 清洗细胞 3 次，使用 200 μL 的 RIPA提取细胞全蛋白，4 ℃，12 000 r/min，5 min，离心（r=9.5 cm），提取上清，使用 thermo BCA试剂盒测量蛋白浓度，对蛋白质提取物进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS.PAGE），电转移至 PVDF膜，体积分数为 5％脱脂牛奶室温封闭2 h。分别加入稀释度 1∶500的α2A肾上腺素受体抗体（abclonal公司，货号：A2809）、1∶1 000的 p-Akt抗体（CST公司，货号：4060）、1∶1 000的Akt抗体（CST公司，货号：9272）和稀释度为 1∶5 000的GAPDH一抗（CST公司，货号：5174），再加稀释度为 1∶100 000 的兔二抗（thermo 公司，货号：G-21234），显影后观察成像结果。1.3 统计学方法数据均以均数±标准差表示，应用 SPSS 和GraphPad软件进行统计分析和图表制作。本研究中的巨噬细胞吞噬率和灰度分析中的相对灰度密度均符合正态分布，且方差齐，3组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用Tukey′s法，以P < 0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 RAW264.7细胞上存在α2A肾上腺素受体不同蛋白上样量下，RAW264.7 细胞中均有α2A肾上腺素受体的存在，蛋白上样量越高，α2A肾上腺素受体的含量越多（图 1）。图 1 RAW264.7细胞上有α2A肾上腺素受体的表达Fig.1 Expression of α2A adrenergic receptor inRAW264.7 cellsα2AR2 μg 5 μg 20 μg吴 珊，等. 右美托咪定受体依赖性增强巨噬细胞吞噬功能 269中山大学学报（医学科学版） 第41卷2.2 RAW264.7细胞吞噬荧光颗粒DEX能使RAW264.7细胞吞噬的荧光颗粒增多，而α2A肾上腺素受体抑制剂 BRL44408逆转吞噬能力的增强（P<0.001；图 2，表 1）。Red fluorescence is the fluorescent particles that phagocytosis by RAW264. 7. A：100×；B：200×图 2 RAW264.7细胞吞噬荧光颗粒Fig.2 RAW264.7 phagocytic fluorescent granulesControl DEX BRL44408+DEXAB2.3 RAW264.7细胞的吞噬率DEX的处理使RAW264.7细胞吞噬率为（30±0.66）%（P < 0.001），预先使用α2A肾上腺素受体抑制剂BRL44408后RAW264.7细胞吞噬率为（22.8±0.21）%（P < 0.001；图 3、表 1）。图 3 RAW264.7细胞的吞噬率Fig.3 Phagocytosis rate of RAW264.72502001501005000 102 103 104 105PE-ABlank0 102 103 104 105Comp-PE-AControlComp-PE-A subset22.9%0 102 103 104 105Comp-PE-ABRL44408+DEX0 102 103 104 105Comp-PE-ADEXCountComp-PE-A subset22.1%PE-A subset0.00%100806040200Count100806040200CountComp-PE-A subset29.3%100806040200Count270第2期表 1 RAW264.7细胞的吞噬率Table 1 Phagocytosis rate of RAW264.7 （x ± s，n=3）GroupsBlankControlDEXBRL44408+DEXPhagocytosis rate（%）-22.27±0.8630.00±0.6622.83±0.21F137.449P<0.001DEX vs. control P < 0.001；BRL44408+DEX vs. DEX P < 0.0012.4 Akt通路的激活DEX的处理使 RAW264.7细胞内 p-Akt的表达增多（P < 0.001），而 BRL44408的使用抑制Akt通路（P < 0.005；图 4）。3 讨 论人体在工作和生活中不断地接触病原微生物，需有效地清除内源性凋亡的细胞以及在发育、组织更新和修复过程中产生的细胞碎片，才能维持机体正常运转。直径为 0.5~5.9 μm的颗粒的去除是通过吞噬过程进行的［8］。吞噬过程包括对颗粒的识别，与颗粒的结合，对摄入的调节和最后颗粒的破坏。对病原体的内在化和杀灭不仅能阻止其在宿主体内的传播，而且在抗原加工和呈递之前进行，从而触发获得性免疫应答。因此，吞噬作用是有效清除引起疾病的病原体的重要的早期步骤。巨噬细胞是重要的炎性细胞，它的未成熟前体细胞——单核细胞能在血流中循环，从而迁移到组织中分化成巨噬细胞。因此，成熟的巨噬细胞分布在整个人体/动物体内：结缔组织，肠道粘膜下层，肺、肝、脾和特定血管中［9］。由于巨噬细胞的分布有针对性，因此可以有效地监控其周围环境，以防感染病原体。为此，它们表达了各种细胞表面受体，例如甘露糖受体，葡聚糖受体，清道夫受体以及 Toll样受体等等，配体与此类受体的结合会引发巨噬细胞的吞噬［10］。通过呈递细菌抗原来刺激淋巴细胞，并通过分泌信号蛋白（即细胞因子和趋化因子，例如 IL-1β，IL-6，TNF-α，CXCL8）激活其他免疫细胞。巨噬细胞对免疫反应的激活有助于诱导炎症，这是成功防御病原体的前提。除抵抗感染外，巨噬细胞在维持组织健康中也起着至关重要的作用。例如，在伤口修复中，巨噬细胞清除死细胞和碎片至关重要［11］。因此，巨噬细胞的吞噬功能在抵御病原体入侵、清除坏死癌变细胞和细胞碎片、维持机体稳态中具有重要的作用，对巨噬细胞吞噬功能的调控能为调节炎症反应、免疫系统和组织修复提供可能性。DEX是一种α2肾上腺素受体激动剂，而α2肾上腺素受体是一种G蛋白偶联受体，其激动后能抑制钙离子通道、激活钾离子通道等介导其临床上的镇痛镇静功能。我们团队既往的研究表明肠道上皮细胞和肾小管上皮细胞上的α2A肾上腺素受体与 DEX在器官缺血再灌注损伤中的保护作用相关［12-13］。其他的研究同样发现，DEX能在脓毒血症模型中保护肾、肝、肺和肠道等受损伤，其机制可能与减轻线粒体融合和裂变的变化、减轻细胞凋亡、减轻了脓毒血症引起的 Th1/Th2的失衡、减轻肠道微循环功能障碍等相关［14-16］。但是，很少有研究关注脓毒血症过程中 DEX对免疫细胞的作用。同时，以往的研究也并没有提到免疫细胞上是否有α2A肾上腺素受体，我们的结果显示 RAW264.7 巨噬细胞上有α2A 肾上腺素受体的存在，我们进而假设 DEX能通过 RAW264.7巨噬细胞上有α2A肾上腺素受体而促进其吞噬功能，研究结果也表明，DEX 的使用能提高 RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能，α2A肾上腺素受体抑制剂1）vs. Control P < 0.001；2）vs. DEX P < 0.005图 4 Akt通路的激活Fig.4 Activation of Akt pathwayControl DEX DEX+BRL444081）2）2.01.51.00.50.0p-Akt/Akt（NormalizedtoControl）p-AktAktGAPDH吴 珊，等. 右美托咪定受体依赖性增强巨噬细胞吞噬功能 271中山大学学报（医学科学版） 第41卷BRL44408 逆转这一吞噬功能的提高，提示α2A肾上腺素受体介导了巨噬细胞的吞噬功能。这为DEX通过对巨噬细胞吞噬功能的调节而在感染相关疾病中发挥器官保护作用提供了理论的基础。有研究表明，人参皂苷能够通过激活 Akt通路增强巨噬细胞的吞噬功能［17］，在我们的研究中，DEX能通过α2A肾上腺素受体而增强巨噬细胞的吞噬能力，而既往也有研究表明 DEX 能够激活Akt通路而发挥抗氧化应激、抗凋亡的作用［18］，而通过我们的研究同样表明 DEX 能够激活RAW264.7 巨噬细胞的 Akt 通路，BRL44408 的使用逆转该通路的激活，这些结果均表明DEX可能通过α2A肾上腺素受体激活Akt通路，进而增强巨噬细胞的吞噬功能，这为DEX的器官保护作用提供了一个新思路。参考文献［1］ Wynn TA，Chawla A，Pollard JW. Macrophage biol⁃ogy in development，homeostasis and disease［J］.Nature，2013，496（7446）：445-455.［2］ Xiang P，Chen T，Mou Y，et al. NZ suppressesTLR4/NF-kappaB signalings and NLRP3 inflamma⁃some activation in LPS- induced RAW264.7 macro⁃phages［J］. Inflamm Res，2015，64（10）：799-808.［3］ Bode JG，Ehlting C，Haussinger D. The macro⁃phage response towards LPS and its control throughthe p38（MAPK）- STAT3 axis［J］. Cell Signal，2012，24（6）：1185-1194.［4］ Cho JS，Shim JK，Soh S，et al. Perioperative dex⁃medetomidine reduces the incidence and severity ofacute kidney injury following valvular heart surgery［J］. Kidney Int，2016，89（3）：693-700.［5］ Gu J，Chen J，Xia P，et al. Dexmedetomidine atten⁃uates remote lung injury induced by renal ischemia-reperfusion in mice［J］. Acta Anaesthesiol Scand，2011，55（10）：1272-1278.［6］ Yu X，Chi X，Wu S，et al. Dexmedetomidine pre⁃treatment attenuates kidney injury and oxidativestress during orthotopic autologous liver transplanta⁃tion in rats［J］. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：4675817.［7］ Sezer A，Memis D，Usta U，et al. The effect of dex⁃medetomidine on liver histopathology in a rat sepsismodel：an experimental pilot study［J］. Ulus Trav⁃ma Acil Cerrahi Derg，2010，16（2）：108-112.［8］ Ernst JD. Bacterial inhibition of phagocytosis［J］.Cell Microbiol，2000，2（5）：379-386.［9］ Varol C，Yona S，Jung S. Origins and tissue-con⁃text-dependent fates of blood monocytes［J］. Immu⁃nol Cell Biol，2009，87（1）：30-38.［10］Bryant C，Fitzgerald KA. Molecular mechanisms in⁃volved in inflammasome activation［J］. Trends CellBiol，2009，19（9）：455-464.［11］Murray PJ，Wynn TA. Protective and pathogenicfunctions of macrophage subsets［J］. Nat Rev Immu⁃nol，2011，11（11）：723-737.［12］Lv P，Chen T，Liu P，et al. Dexmedetomidine At⁃tenuates orthotopic liver transplantation- inducedacute gut injury via alpha 2-adrenergic receptor-de⁃pendent suppression of oxidative stress［J］. OxidMed Cell Longev，2019，2019：9426368.［13］Yao H，Chi X，Jin Y，et al. Dexmedetomidine inhib⁃its TLR4/NF- kappaB activation and reduces acutekidney injury after orthotopic autologous liver trans⁃plantation in rats［J］. Sci Rep，2015，5：16849.［14］Yeh YC，Wu CY，Cheng YJ，et al. Effects of dex⁃medetomidine on intestinal microcirculation and in⁃testinal epithelial barrier in endotoxemic rats［J］.Anesthesiology，2016，125（2）：355-367.［15］Zhang JR，Lin Q，Liang FQ，et al. Dexmedetomi⁃dine attenuates lung injury by promoting mitochon⁃drial fission and oxygen consumption［J］. Med SciMonit，2019，25：1848-1856.［16］Zhao W，Jia L，Yang HJ，et al. Taurine enhancesthe protective effect of dexmedetomidine on sepsis-induced acute lung injury via balancing the immuno⁃logical system［J］. Biomed Pharmacother，2018，103：1362-1368.［17］Xin C，Quan H，Kim JM，et al. Ginsenoside Rb1increases macrophage phagocytosis through p38 mi⁃togen- activated protein kinase/Akt pathway［J］. JGinseng Res，2019，43（3）：394-401.［18］Wang X，Zhao B，Li X. Dexmedetomidine attenu⁃ates isoflurane-induced cognitive impairment throughantioxidant，anti- inflammatory and anti- apoptosisin aging rat［J］. Int J Clin Exp Med，2015，8（10）：17281-17288.（编辑 余 菁）272

右美托咪定受体依赖性增强巨噬细胞吞噬功能

https://xuebaoyx.sysu.edu.cn/rc-pub/front/front-article/download/43566162/lowqualitypdf/右美托咪定受体依赖性增强巨噬细胞吞噬功能.pdf

右美托咪定受体依赖性增强巨噬细胞吞噬功能

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Directory of Open Access Journals