用高分辨率的蛋白质双向电泳对人肝癌及正常肝组织的胞浆蛋白质进行检测。结果表明肝细胞癌变后,胞浆蛋白质双向电泳图谱发生了显著改变,总点数增加,蛋白质点的分布向低分子量低等电点偏移,出现了一些新的蛋白质点,有些蛋白质点密度增加,有些蛋白质点密度减少或消失

王理开

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中山医科大学学报` 1 9 8 8年第 9 卷第 4期人肝癌胞浆蛋白质双向电泳的研究王理开 徐晓利 黄文心 周伟雄(生物化学教研室 )提 要 用高分辨率的蛋白质双向电泳对人肝澎及正常肝组织的胞浆蛋白质进行检测。结果表明肝细胞痛变后,胞浆蛋白质双向电泳图谱发生 了显著改变,总点数增加,蛋白质点的分布向低分子量低等电点偏移,出现了一些新的蛋白质点,有些蛋白质点密度增加,有些蛋白质点密度减少或消失。关键词 人肝癌 蛋白质双向电泳 银染色细胞癌变后,基因表达发生了 复 杂 的 改变。利用高分辨率的双向电泳可探测这种复杂变化的内景。我们用人肝癌及正常肝组织作材料,检测了肝细胞癌变后,基因表 达 的 产 物— 蛋白质 1为改变。材 料 与 方 法一、材料1.试 剂 A m p h ol i cn ( L K B ),戊 二 醛( F l u k a ),3一仁( 3一 C il o l a m i d o P r o y l ) d i m e t h y l a-m m o n i a 升 1一 p r o P a n e S u l f o n a t e 简称 C H A p S( s 生g m a ),尿素 ( B IO一R a d ),蛋自分子 量 标 准( B D H ),硝酸银 G R级 ( 成都化学试剂厂 ),丙烯酞胺、双丙烯酞胺及 S D S 均为国内产品,重结品后使用。其余试剂均为分析纯。实验用水均为全玻璃三蒸馏水。2.人肝 及肝癌 组织 选取手术切除 的 孤立包裹型肝癌病例,手术摘出后立刻 用 4℃生理盐水短暂浸洗,仔细分离出癌组织及正常肝组织,分别切一小块,用 10 %福尔马林固定,送病理检查。其余癌组织及正常肝组织分别用液氮速冻,于 一 切℃保存备用。二、方法。 . 胞浆蛋白质样品 的制备 取经病 理 检查报告为原发性肝细胞癌及正常 肝 组 织 各 2克,解冻后剪碎,各加 3 Om l m m M rT l s一 H CI,o.25 M蔗糖, 3 m M 氯化钙 ( p H S.。 ) 溶液,分别用聚四氟乙烯匀浆器匀浆, _上、下 6 次,四层纱布过滤,滤液于 4℃离心, 1 2 , 0 0转 /分,2 0分钟,取上清液加 固体脉至 9.5M 浓度,分装于塑料小管, 一20 ℃保存备用。.2 蛋 白质浓度测 定 用染料结合 法 lt’ ,以 z卜血清白蛋 自作标准。3.蛋 白质双向电泳及染色 参考 口 F ar-r e l l〔 “」和 D u n c a n 〔“ ’等人方法,并作一些改 良,具体操作如下:等电点聚焦 玻璃管内 径 1.2m m,凝 胶高 功 om m,含 4·4% 丙烯酞胺及双丙烯酞胺,忿.`% A m p h o l i n e ( p H 3.5一 1 0占 z / 4, p H S~ 7占 3 / 选 ), 9.S M 脉, 2 % C H A P S, 0.0 1 %T E M E D, 。.% % 过硫酸钱。用 。.02 5 M 磷酸作下槽液 ( 阳极 ),0.沉M 氢氧化钠作上 槽 液( 阴极 )。顶聚 焦, 艺o ov、} 5 分钟, 3 0 0v、1 5分钟, 4 0 v、3 0 分钟。除 去上槽液,于上端加蛋白样品 1 0 0卜g,用样品覆盖液〔“ 〕 1 0件l 覆盖,重新加入氢氧化钠溶液进行聚 焦, 4 OOV、5小时, l 0 0 0v、14 小时,取出凝胶 于 平 衡液〔” 中室温摇振平衡 1 5分钟。第二向采用 10 ~ 15 %线性梯度 S D S一聚丙烯酷胺垂直平板凝胶 电 泳,胶 宽 12 om m,高1 5 om m,厚 l m m,恒 电流电泳,先 7.s m A /板,切分钟,然后 1 5m A /板,至澳酚兰到达凝胶前沿,约需 5 小时。凝胶蛋 白质的染色采用本室改 良的银染色法 〔们。为了作图谱分析,我们以直径为 2.s m m不DOI : 10. 13471 /j . cnki . j . sun. yat -sen. univ (med. sci ) . 1988. 0083·3 0一。含蛋 白样品的聚焦凝胶,在完全相同的条件下聚焦,然后取出凝胶切成 0.SC m 长小段,每小段用 z.Zm l 去 C oZ的 l o m M K C I溶液摇振抽提20 分钟,分别测各段 p H而获得 p H 梯度曲线。走第二向电泳时在一侧加分子量标准蛋 白,电泳后测定它们的迁移率,半对数作图而获得标准分子量曲线。根据 p H 梯度及标准分子量曲线而确定双向电泳图谱中各蛋白质点的分子量及等电点。结 果人肝癌胞浆蛋 白质双向电泳结果如图 2。正常人肝胞浆蛋白双向电泳如图 3。我们根据等电点及分子量的不同,将双向电泳图谱分成A, B , C , D, E , F , G , H,I 九个 区( 图 1 ) 以作图谱分析。本实验测定的蛋白质的等电点在 p H 4.65 一 7.3 4 , 分子量在 0.5~ 10万范围内。在照片上计数各区出现的蛋白质点数,并计算各区点数 占总点数的百分率,结果列于表 1。可 以看到蛋白质点主要分布于等电点为 P H 5.5 0~ 6.3 5 , 分子量为 2.6一 6.0万的 E区和等电点为 p H 6.35 一 7.3 4 , 分子量为 2.6~6·o万的 H 区。无论正常肝或肝癌,此两 区 的蛋白质点数均占总点数 l均一半以上。肝癌组织表 1 胞浆蛋白质双向电泳结果点数的分区比较… 筋” ”’一“一癌’-一’正 常 一丽一…“ ”【` 8一 7 3一.1 9{1 7 7占总数( % )点 数占总数( % )6Q.0自朽了心山J任几卜11234786 0~ 1 0 0 / 4。6 5一 5.5 02 6一 6 0 / 4。6 5一 5.5 05~ 2 6 / 4.6 5~ 5。5 06 0一 1 0 0 / 5.5 0~ 6.3 52 6一 6 0 / 5.5卜 6.3 55一 2 6 / 5.5 0一 6。3 56 0一 1 0 0 / 6.3 5一 7.3 42 6一 6 0 / 6.3 5一 7.3 45一 2 6 / 6.3 5~ 7。3 45 21 27 92 0 50。98。1叹曰门了qCO自ó目..…9自n21.ǔ,土11八Jd5 03 32 74 81一 {一百丽一7。34。82 3。66。0合 计 {5。01 0 0ABCDEFGHl可测出6 86 个蛋白质点,正常肝组织测得 6 46 个点。分子量和等电点相对较低的 B, C 和 F 区的点数及占总点数的百分率,肝癌均比正常为高,分子量和等电点相对较高的 D,G 和 H 区的点数及占总点数的百分率,肝癌均比正常为低。此外低等电点的 A 区,肝癌的点数及占总点数的百分率也高于正常。这些结果表明,肝细胞癌变时,胞浆蛋白质的分布向低分子量低等电点偏移。与正常肝相 比,人肝癌胞浆蛋白质双向电泳图谱中出现不少新的蛋 白质点,或蛋白质点密度比正常增加,有些蛋 白质点在正常肝存在而在肝癌时减少或消失。我们参照N ar a y a n 等x F - se - - ` 口 -一今分子兹 ( 千 )人 O O公 E HC F I图 1 蛋 白质双向电泳图谱分区示意人〔” ’的双向电泳半定量蛋 白质点的方法,用 十 3表示肝癌变时新出现的蛋白质点, 十 1 , + 2表示蛋白质点密度不 同程度的增加,用 一 3 表示在正常肝存在而在癌变时消失 的 蛋 白 质点,. 3 1·淤乏 2 人肝癌一些胞浆蛋 白质点或点群的半定量改变蛋白质点或 点 群等电点( P H )分子量(千 )半定量级 数蛋白质点或 点 群等电点( P H )分子量(千 )半定量级 数2321521一ù一一日0tanUǐ行̀了叮口Jgé..…任月̀往占月任口d八hù七5。2 55。4 0通。8 05。2 05。2 5一 5。4 05。3 8~ 5。4 85。0 0~ 5。4 55。0 55。1 05。3 55。3 55。3 05。6 0~ 5。9 55.6 5~ 5.9 05。6 05。5 5~ 5。8 05。9 55。9 55。5 5~ 5。8 05。6 0~ 5。9 55。7 55。9 55。9 05。9 65。1 55。2 06。3 5~ 6。7 06.9 57 06 65 45 55 34 4 ~ 4 53 13 02 92 81 91 26 46 36 05 65 75 24 43 4~ 4 23 13 02 82 92 02 01 91 72 02 06 65 95 2524 84 43 62 82 71 4。51 4+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ 2+ 3+ 3+ 3+ 1十 3+ 3+ 2+ 2十 3+ 1十 3十 3+ 1+ 2+ 3+ 1+ 3+ 2十 1+ 3+ 3+ 3+ 1十 1+ 2十 3月一3+ 1+ 3十 3+ 3十 2+ 3+ 2十 3B 2 1B 2 2B 2 3B 2 4B 2 5B 2 6B 2 7C 2 1D 2 1D 2 2D 2 3E 2 1E 2 2E 2 3E 2 4E 2 5E 2 6E 2 7E 2 8E 2 9E 3 0E 3 1E 3 2E 3 3E 3 4E 3 5E 3 6F 2 1F 2 2F 2 3F 2 4H 2 1H 2 2H 2 3H 2 4H 2 5H 2 6H 2 7H 2 81 2 11 2 25。0 05。2 0~ 5。4 04。9 56。0 5、 6。4 06。1 0~ 6。3 0。0 5。1 05。7 5. 5。9 56。1 0~ 6。3 06。1 55。9 55。8 56。3 06。3 06。2 06。0 5一 6。1 56。2 0~ 6。2 55.7 55。8 05。8 05。9 56。2 56。2 56。9 06。0 06。2 56。3 0~ 6。5 06。6 0一 7。1 06.5 0~ 6。9 06。8 06。9 56。5 06。8 56。5 56。5 56。9 55 74 8~ 4 94 64 54 42 92了1 38 57 3一 8 06 05 64 9一 5 44 6 ~ 5 44 44 23 93 43 23 32 9一 3 12 8~ 2 93 03 02 72 82 72 32 012。51 2。55 35 3~ 5 64 2 ~ 4 32 92 82 72 72 62 52 4一 2 5尸a0nUCO,立内七OU心.…九h105口八曰n110U二J仗tJ问口0口叹月任尸O月任SJn卜勺U以;.…户n八白丹bh匕ù们内óU,几Q臼,10曰,d任才口八hé̀口1,上é。0上9é JJ:八匕了0nI山9自nJ5b曰.人1占q白O“ù月ant曰马̀ABCDEFGH1·3 3·人原发性肝癌及正常肝组织作材料 的 研 究表明,人肝细胞癌变后胞浆蛋白双向电泳 图谱亦发生显著改变,蛋白质点的分布向低分子量低等 电点偏移,出现了不少新的蛋 自质点,有些蛋 自质点则显著增强,另一些蛋自质点则显著减弱或消失,与动物的实验结果相似。S t a s t n y 等〔 7 〕用人乳腺 癌 组 织,N a r a y a n等〔 5 」用人恶性脑肿瘤组织作材料的 研 究 亦 表明,细胞癌变后蛋 白质双 向电泳图谱有显著改变,出现 了一些新的蛋 白质点。在这些蛋 白质点中,其中有些可能与肿瘤的发生有关,这为寻找和分离人肿瘤相关抗原提供了依据。对这些蛋白质深入的研究可能有助于揭示肿瘤发生为病理机制,也可能有助于发展对肿瘤的诊断技术。有些蛋 白质点在正常肝存在而在癌变肝消失或减弱。这些蛋白质是否在正常肝的基因衷达调控中起作用, 一也位得探入研究。参 考 文 献仁l〕 I3r a o f o r (至五I M.,、 r a p : 。! a n d o e ; 1 5 ; t孟v e n飞e t n o df o r t l飞e q u a n t , t 赶l t o n o f n l , e r o g r a tn q u a n t i t i e s;飞 r o t e j召 u t i l jz in g t l飞e p上Jn c j p 〕e s o f 口厂o t e i n 一 d y eb ; n dlr g.A n a l B i o e h e m 1 9 7 6 ; 7 2 , 2 4 8.〔2〕 0 , F a r r e l l P H,H j g h r e s o l u t i o n t w o 一 d im e n s 二。-n a l e l e e t r o P h o r e s三5 o f P r o t e j n s.J B : 0 1 C h e m旧 75 ; 25 0: 4 0 0 7.〔3」 D u n e a n R, e t a l.E v a l u t io n o f i s o e l e e t r i e f o e-u s i n g r u n n in g e o n d it io n s d u r i n g t w o 一 d l m e n s-o n a l i s o e l e e t r i e f o e u s i n g / s o d i u m d o d e e y ls u l f a t e一P o l y a e r y la m i d e g e l e l e e t r o p h o r e s i s : v a r ;-a t o n o f g e l p a t t e r n s w i th e h a n g i n g e o n d jtzo n sa n d o P t i m i z e d j s o e l e e t r i e f o e u s i n g e o n d it io n s.A n a l B io e h e m 1 9 8 4 ; 1 3 8 : 1叹4.口 〕 蔡晓丹,等。一种改良的蛋白质双向电泳银染色法。生物化学与生物物理进展 1 9 8 6 ; 3,6。仁5 ] N a r a y a n R K, e t a l.P r o t e i n P a t t e r n s jn v a r i o u sm a l jg n a n t h u m a n b r a i n t u m o r s b y t w o 一 d j m e n-s主o n a l g e l e l e e t r o Ph o r e s i s C a n e e r R e s.2 9 8 6 ;4 6 : 4 6 8 5。巨6」蔡晓丹,等( )D A B 诱发大 自鼠肝癌的研 究—洲用双向电泳枕测你变后蛋白质的改变。 ,i, 山区吞l一友学学报 【9 3 7; 8 ( 3 ) ` 工。厂了了 S t a s t n y J, e t a l.T js s u e P r o t e ; f : s : n b r e a s te a n e e r a s s t u d i e d b y u s e o f t w o一d j me n s io n a le l e e t r o p h o r e s i s.C l i n C h en l 。 )̀ 8 { ; ; G : 工9 1凌.C y t o s o ] P r o te i n P a t t e r n o f H u m a n H e P a t o xn ai n T w o一d i m e n s io n a l G e l E l e e t r o Ph o r e s i sWa n g L i k a i X u X i a o l iI J u a n g We n x i n Z h o u We i x i o n g毛D e P a r t m e n t o f 七 i o e h e m i s t r y )A b s t r a C tC y t o s o i p r o t e i n s w e r e P r e p a r e d f r o nl h u m a n 11 e P a t o m a a n dc l y o b t a i n e d f r o m s u r g e r y.T w o 一 d i m e n s i o n a l g e l e l e e t r o P h o r e s i st o s t u d y P r o t e i n P a t t e r n.T h e m o l e e u l a r w e i g h t r a n g e d f r o :飞,,n o r m a l l i v e r t l s s u e s r e s P e e t i v-w i t h s i l v e r s t a i 二,i三飞二互 ;丫 a s u s e d士。 , O自 0 0 0 a n d t h e i s o e le-e t r i e P o i n t s r a n g e d f r o m P H 4.6 5 t o 7.3 4.T h e g e l s w e r e d i a g r a m e。 孟力 i (二 ) a r e a s a e e o r d i n g t om o l e e u l a r w e i g h t a n d i s o e l e e t r i e P o i n t a n d a l P h a b e t i z e d 介 o m A t o 1.T h e P r o t e i n s P o t s w e r ee o u n t e d, a n d t h e s P o t d e n s i t i e s w e r e e o m P a r e d b e t w e e n h e P a t o m a a n d n o r m a l l i v e r t i s s u e.T h er e s u l t s i n d i e a t e d t h a t t h e r e w a s a s i g n i f i e a n t d i f f e r e n e e o f P r o t e i n P a t t e r n s i n Z一D g e l e l e e t r o-P h o r e s i s b e t w e e n h e P a t o m a a n d n o r m a l l i v e r t i s s u e s.6 8 6 s P o t s i n h e P a t o m a a n d 6 4 6 s P o t s i nn o r m a l l i v e r t i s s u e s w e r e i d e n t i f i e d,B u t t h e P r o t e i n s P o t s o f h e P a t o n a t e n d e d t o d i s t r i b u t e a tr e l a t i v e l y l o w e r m o l e e u l a r w e i g h t a n d l o w e r i s oe l e e t r i e P o i n t a r e a s.A m o n g t h e s t r i k i n g s P o t s,2 7 s P o t s a n d 2 e l u s t e r s o f s P o t s i n h e P a t o m a w e r e n o t n o t e d i n n o r m a l l i v e r t i s s u e s : 1 3 s P o t sa n d 7 e l u s t e r s o f s P o t s i n h e P a t o m a h a d h i g h e r d e n s i t i e s t h a n t h o s e i n n o r m a l l i v e r t i s s u e s ;1 9 s P o t s a n d 2 e l u s t e r s o f s P o t s i n n o r m a l l i v e r t i s s u e s w e r e n o t n o t e d i n h e P a t o m a ; 1 2 s P o t sa n d 1 0 e l u s t e r s o f s P o t s i n h e P a t o m a h a d l o w e r d e n s i t i e s t h a n t h o s e i n n o r m a l l i v e r t i s s u e s.K e y w o r d s : H u m a n h e P a t o m a T w o 一 d im e n s i o n a l g e l e le c t r o p h o r e s is

人肝癌胞浆蛋白质双向电泳的研究

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