外周血正染红细胞微核检查是发现体内染色体损伤一快速方法。本文以不同剂量的环磷酰胺（5、10、15、20、25、30mg/kg）用腹腔注射染毒断奶雄性小鼠。连续5天染毒（从星期一到星期五）。对照组注别蒸馏水。实验结果是:骨髓多染红细胞微核率分别为6.88±0.89,12.33±0.37、20.00±0.49、24.89±0.52、24.75±0.55（‰）,对照组为3.00±0.64;外周血正染红细胞微核率是5.25±0.26、5.06±0.24、6.31±0.28、6.06±0.26、8.44±0.32、7.06±0.28,对照组为1.79±0.16（‰）。与对照组比较均有十分显著的升高。有明显的剂量反应关系。外周血正染红细胞微核率只5天染毒以后就达最大稳定状态,以后两周没有变化。骨髓和外周血微核率相关分析,相关系数分别是γ1=0.99,γ2=0.86,相关系数有显著意义（P<0.01）,外周血正染红细胞微核率是用于发现暴露人群染色体损伤一有效指标

许发茂

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中山医科大学学报 1 9 8 6年第 7卷第 3期小鼠外周血正染红细胞微核的初步研究许发茂 张 桥 邓丽霞 黄俊明*齐道华*王家骥今樊健康招( 卫生系劳动卫生与职业病教研室 )摘要 外周血正染红细胞微核检查是发现体内染色体损伤一快速方法。本文 以不同剂量 的 环 磷 酞 胺 ( 5、10、15、2 0、2 5、3 0 m g / k g ) 用腹腔注射染毒断奶雄性小鼠。连续 5 天染毒 (从星期一到星期五 )。对照组注射燕馏水。实验结果是:骨髓多染红细胞微核率分别为 6.8 8士 0.89、12.3 士 0.37、2。。0 士 0.龄、2 4。8 9 士 0.52、2 4.7 5 士 0.5 5 (隔 ),对照组为 3.0 0 土 0.6 4 , 外周血正染红细胞微核率是 5.2 5 土 0.2 6、5.0 6 土 0.2 4、6.3 1士 。 . 艺8、6·0 6士 0.2 6、8.4凌士 0.3 2、7.0 6 士 0.2 8,对照组为 1.7 9 士 0.1 6 (编 )。与对照组 比较均有十分显著 J飞勺升 高。不J`明显的剂量反应关系。外周血正染红细胞微核率只 5 天染毒以后就达最大稳定状态,以后 两周没有变 化。 `丹髓 和外周血微核率相关分析,相关系数分别是 丫: 二 0。9,丫: 二 0.86,相关系数有显著意义 ( P < 0.01 ),外周血正 染红细胞微核率是用于发现暴露人群染色体损伤一有效指标。关锐词 红细胞微核 淋巴细胞微核 相关分析微核试验用于鉴定化学物质的致突变性及环境因素对人类遗传物质损伤监测 的报 道 甚多〔’ 一 5 〕 。近年来微核试验方法不断地改进和发展。检测的细胞也常用啮齿类动物骨髓多染红细胞 ( 以下称骨髓 P C E )和外周血淋 巴细胞。目前可用多种器官组织细胞检 查 微 核 ( 肝 细胞、早期精细胞、小鼠脾细胞、外周血 P C E、颊粘膜脱落鳞状上皮 细 胞、空 肠 上 皮 细 胞等〔。~8 ’ )。环境因素对于人群染色体损伤的检测一般多用外周血淋巴细胞。该法虽较简便、快速,但需血量较多 ( 1毫升以上 ),并需分离淋巴细胞。难于开展人群监测。为了研究更加简化,易于为广大被检者接受的微核检测方法,我们用已知的致突变物诱导小鼠骨髓 P C E与外周血正染红细胞 ( 以下称 N C E ) 微 核 的相关程度,初步探讨了红细胞微核用于监测环境因素对人群遗传机构损伤的可能性。材 针 和 方 法一、动 物 选用中山医科大学动物房繁殖的昆明种断奶雄性小 鼠,体重为 12 ~ 16 克。第 1次实验选用 18 只,随机分为三组,一组对照,两组实验组。第 2 次实验选用 70 只小鼠,随机分为 7 组,一组对照, G个实验组。二、药物及给药方式 用上海十二制药厂生产的环磷酞胺作受试物。第 1次实验设两个剂量组,分别为 10、动 m g / k g。腹腔 注 射 给药,每天 1 次,每周 5 天,共 3周。每周星期一开始给药,星期六、日停药,下周 星期一采血制片。第 3周后处死动物制作骨髓和血片标本。第 2 次实验设六个剂 量 组,分 别 为 5、1 0 、 1 5、2 0、 2 5、3 0 m g / k s,每天腹腔给药一次连续 5 天,下周星期一处死动物,制作骨髓和血片。两次实验均以蒸馏水作对照。三、制片方法1.夕卜周血微核标本的制备 在小 鼠尾部剪一小段 ( 约 3 毫米 ),取 10 口,滴于事先 备有一小滴小牛血清的载玻片上,棍匀推片,待血片完全干后,用甲醇固定 10 分钟,晾干后,先用瑞氏液染 10 分钟,用清水冲去 染 液,干后,再用 1,10 G ic m as }染液复染 10 分钟,清水洗去染液,晾干后待检。2.骨髓 P C E 标本制备 处死动物后,取出胸骨,剔除附在骨上的肌肉,再用止血钳挤.我校卫生毒理进修班学员DOI : 10. 13471 /j . cnki . j . sun. yat -sen. univ (med. sci ) . 1986. 0035压胸骨,在先备有一小滴小牛血清 的载 玻片上直接涂片,干后用甲醉固 定 晾 干,用 1:10G i e m sa 染液染色,清水洗去染液,干后待检。四、微核计数及统计处理1.血片 每 鼠油镜下计数 2 0 0 0 个 N C E,算出微核千分率。2.骨髓片 每鼠油镜下计数 1 0 0 0个 先 整P c E,计算其微核千分率。·2 7·H ar t ( 1 98 3) 报道,微核 自发率呈两项分布或泊松分布〔 , 1 ,本次实验结果用二项分布进行统计处理。结 果一、第一次结果1.投药 3周,每周外周血 N C E 微核率见表 1。表 1 环磷酞胺三周染毒诱发小鼠外周血 N C E 微核率药 物剂 量( m g / k g )01O2 0动物数 第 1 周(只 )微核率(编 )标准误第微核率(编 )周标准误第 3 周微核率 标准误(编 )蒸馏水环磷酞胺环磷酞胺* , P < 0。0 1土 O。3 7上 O。5 3几 O。61。33。7 * *二.3* *士 0。3 3上 O。5 5.9巾 * 士 O。5 7士 0。6 6 上 0。4 6申今平串叮J月八恤d…_L述结果可见,弟 1 周投药 以后,环磷限胺诱发小鼠外周 血 N C E 微 核 率 10 m g / k g 组为 3.吐%。 , 2 0 m g / k g 组为 4.3从,均比对照组1.7肠高 ( P < 0·01 ),以后两周各组微核率波动不大 ( P > O,。 5 )。经 5 次投药外周 血 N C E 微核已达稳定状态。2.外周血 N C E 与骨髓 P CE 微核诱导率相关性研究,见表 二。表 2 环磷酞胺诱导小 鼠外周血 N C E 与骨髓 P C E 微核率fltJ 虽( m g / k g )动物数药 物 计数细胞数标准误(只 )外 )习 止I N C E计数细一微核率一标准误胞数 (输 )蒸馏水环磷酞胺环磷酸胺5 0 0 0 士 0,1 9 1 0 0 0 0 1。1 士 0。3 31 02 06 0 0 0 1 3。56 0 0 0 2 0。0 0土 0。4 7 1 2 0 0 0 3。士 0。5 7士 0。3 7 1 2 0 0 0 士 0。理6从表 2 可见,环磷酞胺诱导小 鼠骨髓 P C E和外周血 N C E 微核率均有明显的剂量反应关系。骨髓 P C E 微核率比外周血 N C E 微核率高 3 一 凌倍。骨髓 P C E 与外周血 N C E 微核频率相关性绘于图 1,呈直线相关,相关系数丫 , = 0.9 9,有高度显著性 ( P < 0.01 ),两 者 有高度相关。据此计算回归方程式为:; 二 0.78 十 O·2 2 x二、第二次实验结果骨髓 P C E 与外周血 N C E 微核诱导率见表 3。从表 3可见环磷酞胺诱导小 鼠骨 髓 P C E和外周血 N C E 微核率,两者均呈剂量反应关系。骨髓 P C E 与外周血 N C E 微 核 率作 相关分析,根据该资料绘制微核频率分 布 相关图 2,呈直线相关,相关 系 数 Y: 二 0.86,相关系数有高度显著性,( P < 0.01 ),两者 密 切相关。计算出回归方程式为:;二 3.6 8 x 一 理,C4. 2 8 .表 3 环磷酞胺诱导小鼠骨髓细胞与外周血 N C它 微核率刘 量药 物( m g / k g )蒸馏水 0环磷酸胺 5环磷阮胺 10环磷酞胺 15环磷酞胺 2 0环磷酞胺 25环磷酞胺 30动物数(只 )骨 髓 P C E计数细 撷孩率 标准误胞数 (喻 )外计数细胞数周 血 N C E微核率( %。)标准误7 00 080 0 0900 080 0 09 0 0 08 00 09 00 03。006一8 81 2。3 32 0。0 02 4。8 92 4.7 52 5。56士 0。6 4土0。8 9土 0一3了土 0.4 9士 0。5 2士 0。5 5士 0一5 31 4 0 001 60 001 8 00 01 6 0 001 8 0 0 01 6 0 0 01 8 0 0 01。7 95。5 25一0 66。3 16。0 68。4 47。OG士 0。16土 0。2 6士 0。2 4士 0。2 8土 0。2 6士 0。3 2土 0。2 8QùSC口已心浦烧n口八澳à娜挺膝山QZ家叹周次 6 8 土O骨随 P C E 微核 率图 i 骨髓 P CE 与外周血 N C E 微核分布图._/ / 才/一/尸/尸沪/。,护扩了长沙`目 j . . . . J冲护 J ` 内 九衡.~侧` . . 坷几加 . 目一, 曲协口 州碑己 1了一 竺 J 鑫二二 }亡n协8户一f,心咋只几ù1(澳à哥地担U国Z曰硬家骨脸 P C E 微核率图 2 骨髓 P C E 与外周血 N C E 微核率分布图讨 论S c h l e g e l 等 ( 2 9 5 2 年 )【’ 。 ’提出周围 血中N C E 的微核率可能是小鼠慢性染色体损 伤 一有用指标,该作者 1 9 8 3 年报告了〔川 各类遗传毒物的实验结果,认为外周血 N C E 微核对多次染毒动物累计染色体损伤是敏感的,常规的毒性研究使用的重复染毒期超过红细胞寿命。1 9 5 2年 Sc h l e g e l 等用三 乙烯亚胺三嗦 ( T E M )诱导小鼠微核,再次证 明骨髓 P C E 染色体断裂能使小鼠外周血 N C E 内的微核积累,在停止 T EM 注射后,高水平的 N C E 微核仍高于对照组 30 天左右,具微核 N C E 寿命非常接近正常红细胞的寿命【` , ’ 。由于微核蓄积于 外 周血液中,并在血涂片中易于检查,所以用于亚急性和慢性实验是适宜的。我们的实验也证明具微核 N C E 并不被选择地从血液中清除,并用简单血涂片即可计数微核率,简化了操作手续,又节省人力物力,为检测染色体损伤,提供了快速、经济的方法。S c h e l e g e l 等 ( 1 9 5 3 )川’报道了环磷酸胺等6 种遗传毒物非致死剂量投毒,有些毒物连续5 天给药之后,可使外周血 N C E 微核率明显增加,有些毒物 ( 如氮芥 ) 要 大 约 5 周 染 毒才达最高稳定状态。我们使用的环 磷 酞 胺 仅5 m g k/ g,连续 5 天给药,就能使外周血 N C E微核显著升高,以后两周微核率无明显变动,与该作者结果一致。M a c G r e g o r F J 〔” ’ 等认为外周血 N cE 微核率是慢性染色体断裂一有效指标。我们两次实验所得结果同样证明:环磷酞胺诱发小鼠骨髓 P C E 和外周血 N C E 微核率都有明显的剂量反应关系。两者微核发生率相关性分析,有密切相关,相关 系 数 Y: = 。.”,Y: 二 。.86。该法需血量少,看来会较易为受检者接受,方·2 9·法简单,计数方便,适于大量人群监测。在实验中我们发现 N C E 经胞膜吐核,出现排微核现象,这是否由于红细胞维持自身稳定或其他因素所致,有待进一步研究。这种排核现象,可能是导致外周血 N C E 微核率低于骨髓 P C E 微核率的原因之一。( 我院卫生毒理进修班学生曲美燕、李变兰、徐雅如参加部分工作特此致谢 )m P a r is o n o f s i s t e r 一 e h r o m a t id e x e h a n g ea n d t h e m i e拍 n u e l e u s t e s t i n m o u s e f o e t a ll iv e r e r y t h r o b l a s t s.M u t R e s 1 9 8 3. 1 1 3 :6 1。〔7〕 S t ic h, e t a l.U s e o f t h e m i e r o nue le u s t e s tt o m o n i t o r t h e e f f e e t o f v i t a m i n A,b e t a一 e a r o t e n e a n d e a n t h a x a n t h i n o nb u e e a l m u e os a o f b e t e l n u t / t o b a e e ot h eCh e-参 考 文 做〔1〕 顾祖维,等。鉴定化学品诱突变的快 速 方法— 微核试验。国外医学卫生分册1 9 8 1 ; ( 3 ) : 1 4 4。【2〕 H 6 g s t e d t B、 e t a l.M i e r o n u e l e i a n d C h r o-m o s o m e a b e r r a t i o n s i n b o n e m a r r o w e e l lsa dn l y m hPo e y t e s o f h u m a n s e x P o s e dm a i n l y t o Pe t r o le u m v a P o r s.H e r e d i t a s1 9 8 1 ; 9 4 : 1 7 9。阳 〕 许发茂,等。苯、砷、铅作业工人外周血淋巴细胞微核率的研究。职业 医学 1 9 8 4, 4 :2 0。[_4」钟宝珍,等。苯、甲苯、二甲苯细 胞 遗传学效应的比较研究。遗传 1 9 5 0 , 2 ( 2 ): 2 9Q「5了 H e n d e r s o n L, e t a l,S i s t e卜 e h ro m a t ide x e h a n g e a n d m i e r o n u e l e u s i n d u e t i o n a si n d i e a t o r s o f g e n e t i e d a m a g e i n m a t e r n a la n d f o e t a l e e l l s.M u t R e s 1 9 8 4 多 1 2 6: 4 7.〔6〕 C o l e R J, e t a l.S h o r t一 t e r m t e s t f o r t r-a n s Pl a e e n t a l ly a e t i v e e a r e i n o g e n s A e o-w e r s.I n t J C a n e e r 1 9 84 ; 3 4 : 74 5。〔8〕 G o l d b e r g M, e t a l.oC m Pa r i s o n o f t h ee f f e e t s o f i,2 一 d im e t h y l h y d ar z i n e a n de y e l o Ph o s P h a m i d e o n 功 i e r o n u e l e u s i n e i d-e n e e i n b o n e m a r t o w a n d C o l o n.M u tR e s 1 9 8 3 , 10 9 : 9 1。〔g j H a r t J W, e t a l.S t a t is t i e s o f t h e m o u s eb o n e 一 m a r r o w m i e or n u e l e u s t e s t : e o u n t i n sd i s t r i b u t i o n a n d e v a lu a t i o n o f r e s u l t s.M u t R e s 1 9 8 3 ; 1 1 1 ( 2 ): 1 9 5。〔1 0〕 S e h l e g e l R, e t a l.T h e P e r s i s t a n e e o fm i e or n u c l e i i n P e r i Ph e r a l b l o o d e r y t h or-e y t e s : d e t e e t i o n o f e h or n i e e h r o m o s o m eb r e a k a g e i n m i e e.M u t R e s 1 9 8 2 ; 1 0 4宝 3 6 4。厂2 1」 S e h l e g e l R, e t a l.A ar P i d s e r e e n f o re u m u l a t i v e e h r o m o s o m a l d a m a g e i n m i e ee u m u Za t i o n o f e i cr u l a t i n g m i e or n u e l e a t e de r y t h r o e y t c 弓 M u t R e s 1 9 8 3; 1 1 3 : 4 8 1.〔 1 2口 D e S e r r e s F J, e t a l.E n v i r o n m e n t a lmut a g e n e s i s a n d e a r e i n o g e n e s i s : t e s t 功 e t h·o d d e v e l o P m e n t, v a l i d a t i o n a n d u t i li z a t i o n.M U t R e S 1 9 8 4一 1 3 0 . 3 5 3。必3 OP r e li m i n a r y S t u d i e s o f Me r o n cu el u s i n P e r i P h er a lN o r m o ch r o m a ti e E r y t h r o e y t e S i n M i c eX u aF m a o Z h a n g Q ia o D e n g L i x i a Wa n g J u n m i n gJ i D a o h u a W a n g J iaj i F a n J i a n k a n g(D e P a r tm e n t o f I n d u s t r i a l H y g i e n e a n d o c c u Pa t i o n a l D is e a s e s )A bst r a ctT h e m i e r o n u e l e u s t e s t o f P e r i P h e r a l n e r m o e h r o m a t i e e r y t h r o e y t e s w a s P r o v e n to b ea r a Pi d m e t h o d fo r d e t e e t i n g e h r o m o s o m a l d a m a g e i n v i v o.T h e e x P e r i m e n t s w e r e e a r r i e do u t i n w e a n li n g m i e e.T h e f r e q u e n e i e s o f m i e r o n u e l e a t e d e e l ls P e r 1 0 0 0 P e r i P h e r a l n o r m o-e h r o m a t i e e r y t h r o e y t e s i n m i e e a f t e r 5 da i l y (M o n da y t h r o u g h F r i da y ) i n t ra P e r i to n e a l i n je-e t io n s o f e y e lo p h o s P h a m i d e i n do s a g e o f s, 1 0 , 1 5 , 2 0 , 2 5 a n d 3 0 m g / k g w e re 5.2 5 士0.2 6, 5.0 6 士 0.2 4 , 6.3 1士 0.2 5 , 6.0 6 士 0.2 6 , 8.4 4 士 0.3 2 , 7.0 6 士 o.2 8 a n d t h a t i n b o n em a r r o w P o l y e h r o m a t i e e r y t h r o e y t e s w e r e 6.8 8 士 0.8 9 , 1 2.3 3 士 0.3 7, 2 0.0 0 土 0.4 9 , 2 4.8 9士 0.5 2 , 2 4.7 5 士 0.5 5 r e s P e e t e v e l y.T n e r e s u l t s w e r e s i g n i f i e a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f t h ee o n t r o l, a n d a d i s t i n e t d o s e一 r e s P o n s r e l a t i o n s h i P w a s s h o w n.T h e f r e q u e n e i e s o f m i e r o n u e l e i o f P e r i P h e r a l n o r m o e h r o m a t i e e r y t h r o e y t e s r o s e t o as t e a d y s t a t e a f t e r t h e m i e e w e r e t r e a t e d o n l y 5 d a y a.T h e r e a f t e r,t h e r e w e r e t o e h a n g e sw h e n t h e m i e e w e r e t r e a t e d f o r a n o t h e r t w o w e e k s.A h i g h e o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e f r e q u e n e i e s o f m i e r o n u e l e i i n P e r i P h e r a l n o r m o e h r o m a t i ee r y t h r o e y t e s a n d t h a t o f b o n e m a r r o w P o l y e h r o m a t i e e r y t h r o e y t e s w e r e o b s e r v e d.T h ee o r r e l a t i v e e o e f i e i e n t w e r e 0.9 9 a n d 0.8 G.T h e r e s u l t s h o w s t h a t t h e m i e r o n u e l e u s t e s to f P e r i Ph e r a l n o r m o e h r o m a t i e e r y t h r o e y t e s m a y b e a n u s e f u l m e t h o d f o r d e t e e t i n g t h eeh r o m o s o m a l d a m a g e.

小鼠外周血正染红细胞微核的初步研究

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