采用sephadex G-50F柱层析及CM-sephadex C-50离子交换柱梯度洗脱法,从峰毒中分出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ组分。 全峰毒对小白鼠的LD50为4.32mg/kg(3.91～4.76mg/kg)。全蜂毒对电刺激小白鼠的痛嘶叫反应有明显的抑制作用,2.16mg/kg剂量的抑制率达90％(P<0.05),1.44mg/kg的为55％。全蜂毒及组分Ⅱ的镇痛作用有明显的量—效关系及时—效关系。以小鼠热板法测定的全蜂毒的ED50为1.20mg/kg;组分Ⅱ为1.02mg/kg。1小时起效,5小时达高峰,持续12～48小时。但组分Ⅱ的作用时间较短。全蜂毒明显抑制致炎剂引起的炎症反应(P<0.001)。此作用有量效关系。同时,亦明显抑制化学性致热反应

黄永楷

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中山医科大学学报 19 86年第 7卷第 4期蜂 毒 的初 步分 离 与药理 研究黄永楷 马郁琪 刘巨源*王建刚*张翠琴*伍爱蝉* 司效黎*药理教研室 药理研究室摘要 采用 es p h da e x G一50 F 柱层析及 CM一邵 ph da e x C一50 离子交换柱梯度洗脱法,从峰毒中分出 I、I、l 及丁组分。全峰毒对小白鼠的 L D 50 为 4.32 m g八g ( 3.91 ~ 4.76 m g/ k g )。全蜂毒对电刺激小自鼠的痛嘶叫反应有明显的抑制作用,2.1 6m g / k g剂量的抑制率达 90 % ( P < 0.05 ), 1.4 m g /k g 的为 5 %。全蜂毒及组分 I 的镇痛作用有明显的量一效关系及时一效关系。以小鼠热板法测定的全蜂毒的E D 50 为 1.20 m g / kg ; 组分 I 为 1.02 m g /k g。1小时起效,5 小时达高峰,持续 12 一48 小时。但组分 I 的作用时间较短。全蜂毒明显抑制致炎剂引起的炎症反应 ( P < 0.0 01 )。此作用有量效关系。同时,亦明显抑制化学性致热反应。关铆词 蜂毒 镇痛 抗炎蜂毒是蜜蜂科昆虫工蜂遇刺激时从尾部毒囊里排出的毒液。蜂毒主要含有活性多肤,如m e l i t t i n、a p a m i n、M C D 多肤等 ; 另外还含有组织胺、磷酸脂酶 A 及透明质酸酶等〔 ’ 〕。在民间早已应用蜂毒治疗风湿性关节炎等疾病 〔2 ’ 。近儿年来更发现蜂毒中的 aP a m in 对细胞膜 上钙触发的钾通道呈高度 亲和力,抑制钾外流,可作为研究工具〔“ ’ 。 目前,国外对蜂毒的毒性成分进行了深入的研究,但对其生物学作用及其机理的研究有待深入。我国民间应用蜂毒治疗疾病的历史亦很长,但对其研究不多。为此我们对产白我国人工何养的蜜蜂的蜂毒作初步分离及药理研究,除证实其镇痛及 抗 炎 作 用外` 4 , ,还发现有较好的退热作用。实 验 材 针一、蜂毒 由养蜂专业户李光宏提供,是用电束撇法从蜜蜂 ( A iP“ ce r a an ) 上获得。二、_葡聚糖凝胶 G一50 F 及 C一 50 p ha 卜m ac ia 厂产品。其他试剂为国产分析纯试剂。三、小白鼠 为本校动物场繁殖 的 昆 明种 ; 大白鼠购自广东省 计 划 生育 研 究 所 的W i s t a r 种。实验方法与结果一、蜂毒的初步分离参考 S h k en de or v 等方法 〔。 〕 ,按下术步 骤进行。(一 ) S e P h a d e x G 一 5 0 F 柱 层 析 Se P h a d e xG 一 SOF 用 O.IM 醋酸钱缓冲液 ( p H 4.4 ) 浸泡过夜,装柱 ( 40 又 2.S CM ) 平衡 10 小时。全蜂毒 50 Om g 溶于上述缓冲液 3 毫升,离心后取上清液上柱。然后用上述缓冲液 洗 脱,流 速 为2 0m l/ h,以分步收集器收集,每 1 5分钟一管,每管 5 毫升,以日立牌 3 2 3 型紫外分光光度计在 2 8On m 波长测光密度,共得 5 个蛋白吸收峰( 图 1 )。我们收集四个峰,即 I、兀、l 及W,进行实验,其中以 亚峰量较多,生物活性较强。(二 ) CM一 S e p h a d e x C一 5 0 柱层析 将 CM-S e p五a d e X -c s o用 p H 4.6 0.2 5M醋酸按缓冲液浸抱过夜、装柱 ( 3 5又 ZC M ),平衡 2 0小时,取蜂毒组分 1 1 50 m g 溶于 O.25 M 醋酸钱 l m l 内上柱,用 p H 4.6 0.2 5M 醋酸铰与 p H 7.5 1.5M朴 1 9 84年度药理学高级师资班学员DOI : 10. 13471 /j . cnki . j . sun. yat -sen. univ (med. sci ) . 1986. 0049藏一一二-号瑞谕图 1 蜂毒的 s e p h a de x G一 5 0F柱层析醋酸钱缓冲液进行梯度洗脱,流速 1 8m l/ h。每15 分钟收一管,每管 4.s m l,按上法测光密度,得 3个蛋 白吸收峰 亚。 、l 。及 皿。( 图 2 )。图 2 蜂毒组分 I 的 C M一 S eP h ad e xC一 5 0 的柱层析(三 )硅胶 G一 1 % CM C卜N a 薄层层析 用。.2m m 厚硅胶 G一 1 % CM C we N a 薄层 板,以正丁醇:醋酸:水 ( 4: 1 : 5 ) 上层为展 开 剂,将全毒与 I c 进行薄层层析,用布三酮 ( 10 % )喷雾后加热显紫红色斑,其结果表明 l 七为 一斑点。二、全妹毒及其组分的药理作用研究(一 )各组分对大白鼠离体心脏的作用按常规制备 乙a八de n d o 到隆心脏灌流。各组分配成 1 0m g / i 0 0m l的浓度,每次给 1 0一 2 0协s。结果除组分 亚对冠脉流量及心率 略抑 制 外,I、l 及 N 组分对心脏的影响不大。(二 ) 全蜂毒的急性毒性 ( L D。。)选体重 20 士 2 克的健康小鼠,随机分成 5组,每组 10 只,雌雄各半。腹腔注射全蜂毒,观察 24 小时的死亡率,按改良寇氏 法 .1 算 其L乓。及 95 %可信限。全 毒 的 L D。 。为 选.3 2 m g k/ g ( 3.9 1 ~吐.76 m g k/ g )。中毒动物于注毒后初呈兴奋表现,随后转为活动减少,呼吸变慢、浅,最后呼吸抑制死亡,但此时心脏跳动仍存。(三 ) 全毒的镇痛作用1.对电刺激尾巴的痛嘶叫反应:取健康小鼠20 只分为二组,以二根针形电极 ( 长 Ic m ) 插入鼠尾中段皮下,二电极相距0.s c m,以Y SD一 4 型生理多用仪产生的方波刺激之,并联一台阳 R一 1型双线示波器监测方波的电压强度。刺激参数: 在m s、波宽64 H z,串长 1秒,逐渐升高电压直至小鼠挣扎并发出一种高调的嘶叫声作为疼痛反应的指标。以此电压值作为痛阂。给药前测定三次正常痛闽,二组的比值分别为 3.9 9 土 。.95 伏及 4·2 8 士 1·“伏。然后分别 腹 腔 注 射 全 毒 2.托 m g/ k g 及1.4 m g / k g。给药后 1 小时,重复测定痛 阂,并计算痛抑制率。二组的痛阂分 别 为 5.51 士1.89 伏及 4.70 士 1.86 伏。其中高剂量组的痛阂提高达显著差异 ( p < 0.0 5 )。其痛抑制率 分别为 90 %及 5 %,表明全蜂毒有一定的镇痛作用。2.蜂毒镇痛作用的量效关系:以小鼠热板法测定的全蜂毒的镇痛作用的E DS。为 2.2 om g / k g,组分 兀的为 z.0 2m g / k g。3.蜂毒镇痛作用的时效关系( l) 以电刺激大鼠尾巴致痛嘶叫实验,按前述方法选 1 4。 士 2 0 克的大白鼠20 只,分成二组,一组为对照,腹腔 注 射 生 理 盐 水 s m l/k g,另一组腹腔注射全毒 1.52 mg k/ g,分别侧定给药前、给药后 z、3、5、8、2 4、48及 7 2小时的痛阂。结果显示给药组的痛阂显著高于对照组。于给药后 1小时痛闭开始提高,5 小时达最强。在 4 8小时内痛闭保持在较高的水平。72 小时后才接近对照值。表明全蜂毒的镇痛作用较持久。( 图 3 )。以电刺激尾 巴法,测定大鼠 注 射 组分 l( o.Zm g / k g 主p n = g ) 及生 理 盐 水 ( 0.sm l /20 0 9 i p, n = 9 ) 前及后 1、3、5、7 小时的 痛阀,结果表明组分 皿于 1 小时显效。5 小时后恢复正常 ( 图 5 )。一\ \—一-一卜一龙飞忿一毛; 一二厂一汀一不一“~ 一 , 公`,~ ~ ~ 一 __.图 3 蜂毒镇痛作用的时效关系 ( B V = B eyen o m , 1.516m gk/ g,IP, N S =n o了功 a l Sa ! i n e一 入 一一 一 一 ~ 一 ~ - 一1 一- -一一玄- - - - 一 一一片下下子组分 I 镇痛作用的时效关系 ( 电刺激法,( B V 1 0。Zm g /k g IP )z了了rù一一勺,ù /了`ù|铲别llle.l’1 w.,J!J月`产、(2 ) 以热板法测定小白鼠 ( 16 只 ) 注射全毒 ( 2.1 6m g / k g iP ) 前及后 1、3 、 5、1 2 及 2 4小时的痛闭,亦获近似的结果 ( 图 4 )。\ \_、 、 、月穿一 { 犷竹丁-爪尸一花一忿厂一沂户叨节片图 4 全蜂毒镇痛作用的时效关系 ( 热板法, BV 2.1 6m g八 g,I P )4.组分 l 镇痛作用的时效关系5.全蜂毒对实验性关节炎的抑制作用取健康大白鼠 ( 1 34.2 士 1 4.2克 ),每组功只,其中一半给药,另一半 作对 照,以 精密卡尺测定每鼠右足厚度 ( 定 为 10 % ),然后分别腹腔注射全毒 1.5 1、 1.0 1及 .0 s m g k/ g,给药后 1 小时于右足 礁部 注入 16 % 酵 母 液0.0 5m l,再分别于 0.5、1、2 、 4 及 6 小时 重复测定右足厚度,与给药前作比较,求出其肿胀百分率。结果表明全蜂毒对此炎症模型有明显的抑制作用,此作用有量效关系 ( 表 1 )。另取 20 只大白鼠,按上法测定 1.50 m g / k g剂量的效果,结果表明该剂量全毒显著抑制炎症反应 ( 表 2 )。6.全蜂毒的退热作用取健康大鼠30 只分成三组,以 1 %竣甲基表 1 全 蜂 毒 对 大 白 鼠 化 学 性 关 节 炎 的 影 响组别药 物 与 剂 量(m g /k g )给 药 后 右 足 厚 度 的 改 变 率 ( % )6 (小时 )一一~一一~一一一一-一对一9。3 4 0。5 2 6。1 1 9。0 1弓。40.入.87比UnO工勺J吸7 7。71 2.5 8-…,曰汽U左ó,曰内匕`43 1。4 4。.8.5.4ù匀IÙ吐ù3.…,曰,月才n山,二J工J任qUdùno毒 ( 1。6 1 )照毒 ( 1。0 1 )照毒 ( 0.5 )对蜂__一二·` , 行宁比_ ._一 。卜 。 n认厂比- -一 卜片 。 “ 卜多图 6 全蜂毒对大白鼠化学性关节炎的作用纤维素配制的 7%啤酒酵母混悬液 o.s m l / 1 009皮下注射,以诱发发热反应〔6〕 。待肛温达 39 ℃以上后,二组分别腹 腔 注 射 全 峰毒 1.51 及o.76 m g / k g,另一组注射 。.sm l / k g 生理 盐 水作对照。于给药后 1、3、5、g 及 24 小时测定肛温,结果表明全蜂毒有明显的退热作用 ( 表3,图 7 )。的 E D。 。为 1.2 0m g /k g,与杨毓麟等以化 学刺激法测定的相近闭。组分 企同样有明显的镇痛作用,其 E D。 。为 1.o Zm g / k g,组分 亚似 乎 是全蜂毒镇痛作用的主要成分。我们的实验进一步分析了全峰毒的镇痛作用的特点,发现除有明’显的剂量依从关系外,其作用较慢,一般于给药后 1 小时起效,4 ~5 小时达高峰,但维持时间较长。从文献中了解到峰毒抑制前列腺 素 的,合成,认为其抗炎作用可能与前列腺素合成减少有关” ’ 。如果是这样的话,蜂毒可能有阿斯匹林样的退热作用。从我们的实验表明蜂毒确有抑制致热反应。由此,我们认为国产的蜂毒是由多种生物活性成分组成,有明显的抗炎、镇痛及退热作用,值得进一步研究。老了弓刀v 乙“ 叫 勺乙丫 卜 5 1口【产`更图 7 蜂毒对实验性发热反应的抑制作用讨 论我们对我国的蜂毒成分进行初步研究,发现主要含 5个蛋白峰。从离体心脏的实验发现第 亚峰的生理活性较强。从第 l 峰再进一步作离子交换可进一步分离出 3个带,表明上述几个主峰是由多种毒性蛋白组成。从我们的 L DS。测定结果与文献报导 的近似〔7 ’ 。我们以热板法测定的全蜂毒的镇痛作用参 考 文 献〔月 王本祥。蜂毒的药理及临床应用。药学通报19 80 , 1 5 ( 5 ):2连。〔幻 江苏新医学院。 `于,药大辞典。1 9 7 7 1 p 2 4 8 0[ 3〕 H a b e r m a n n E.A P a m i n.p h a na e o l o g ie a la n d t h e r a P e u t i e s 1 9 8 4 : 2 5 ( 2 ):2 5 5。〔4」 H a b e r m a n n E.B e e a n d w a s P v e n o m.S e i-e n e e 1 972 ; 1 7 7: 3 1 4.〔5〕 S h k e n d e or v 5 a n d 衣 K o b u r o v a.A do l a Pi na nwe l y is ol a t e d a n a l g e t ic a n d an t卜i n f l a m m a to r y P o l y PIP t i d e f r o m b e e v e·n o m.T o x i e o n 1 9 8 2 ; 2 0 ( 1 ):317.〔 6〕 郁晓梅,唐希灿。酵母对小鼠和大鼠的发热作用。药学通报 1 9 8 3 , 1 8 ( 2 ), 1 2·〔 7〕 A T T u.V e on m : C h e m is t r y a dn Mo l e e u la rB i o l o g y P 5 0 1,J o h n w i l e y a n d S o n s:I n e1 97 7。闭 杨彗麟,等·蜂毒镇痛作用的实验研究。一南通医学院学报 1 9 8 3 , 3 (幻:39。一一一孟一一一!ì41相朋1 5哪9。O刊的9邸。O刹卜68的O灼。+l6,仍的闪娜6的工ǎ工。0.èdà的。O囚+I。工9。工扣-H的0(盆令)9O侧。+l仍?哪9的。+lO哪n工囚。O+I卜0.们仍ǎ岔令àǎ沪àǎ昌O。èdà8。的工+l哪闪的闪。O+I卜仍 哪卜。+OI的。6囚仍。+0I勿门6的映O。仍N+I工卜ǎ次í侧稼6闪。O+lN卜哪09。O+l工卜。6的02。+lO帅86仍ǎ工。O。èdà6。刹哪州8O囚闪.辞中蝉仍。哪Z喇6。08亥口卜哪。O+l们.0的哪。O利工卜68叫。O刊的。D洲ǎ10。Oèdà6。1刊卜O囚仍。ON洲帅哪卜恤肖叹孟褥趁6哪。O刊旧囚。畔的对。O+I60侧工的。O书8.0甲扫仲撅瀚叹学军号ù侧忽滚喊州刘御试·粉瞥祠的琳O工X|ǎ90.èdàO。的T+lco。N仍N。6+l叫O甘的.。饵稼貌O价.+0I囚娜。8的9的。O+I工仍们哪Z。+OI的。粉日铡处溜稼貌侧处妇似稼姗·铡迹叹瀚0洲01福椒淞ǎdl曾。畏宕价。。)25产乏。Oà卜山ǎ砚。工à卜山ǎ合的芝切日à娜稼“冲哥出众勾令两.公场芝.日的.忿扮黔公ō汤。T\工日的.0书相倒州毓 篆(01“u)毓橱淞ǎ8”Oí翻眨灰谬缺霍粼积护攀扑翠磁姐友只种黔Z琳令.1 6.T h e P r e l im i n a r y S t u d i e s o f B e e V e n o mH u a n g Y o n g k a i M a Y u q i L i u J u y u a n牵W a n g J i a n g a n g* Z h a n g C u i q i n*W U A i e h a n* 5 1 X i a O I i *(D e Pa r t m e n t o f Pha r m a e o l o g y )A b s t r a C tP e a k l 亚 1 a n d 砰 w e r e o b t a i n e d b y g e l f i l t r a t i o n o f b e e v e n o m o n S e Ph a d e x C -50 F.L D。。 o f b e e v e n o m i n m i e e w a s 4.3 2 m g / k g i·p.( 3.9 2~ 4.7 6m g / k g )·B e e v e n o m5 1即 if i e a n t l y i n h ib i t e d t h e n oe i e eP t i v e r e s P o n s e o f m i e e t o e l e e t r i e s t i m u n a t i o n.T h e i n h i-b i t i n s r a t e O f 2.16 m g / k g a n d 1.4 4 m g / k g we r e 90 % a n d 5 5 ;石 : e s p e c t i v e l y.T h e r e w a sa g o o d r e l a t i o n s h iP b e t w e e n d o s e a n d r e s P o n s e o r t im e a n d r e s P o n s o f o r a n a l g e t i c a c t i o no f b e e v e n o m.E D。 。f o r b e e ve n o m w a s 1.2 0m g / k g·T h e a n a l g e t i c a C t i o n o c c u r e d w i t h i nlh r, r e a r e h e d a P e a k i n 5 h r s a n d P e r s i s t e d 1 2 ~ 理s h r s fo r b e o v e n o m.B e e v e n o m a l s o e x-h i bi t e d a n t i i n f l a m m a t o r y a n d a n t i P y r e t i e a e t i v i t y·K o y w o r d : B e e v e n o m a n a l g e t i c a n t i i n f l a m m a t o r y a n t iP y r e t i e. S t u d e lt o f t r a in i n g e ou sr e o f P h amra e ol o gy 至n 19 8 4

蜂毒的初步分离与药理研究

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