乳腺癌组织中,雌激素受体的有或无,可以预示该肿瘤对内分泌治疗的反应。据报道。乳腺癌雌激素受体阳性病人约2/3可望从内分泌治疗中得到客观上的缓解;受体含量越高,肿瘤对内分泌治疗反应的机率越大。目前检测肿瘤组织受体的方法有多种,本文采用一种简便、灵敏的DCC法(Dextran-Coated Charcoal Procedure)测定人乳腺癌组织雌二醇受体的含量为临床提供内分泌治疗的依据。并且对实验中某些影响因素进行了实验探讨

张怀德

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i幽医鱼大学堂担一1丝旦年笙 ,查笙鱼期人乳腺癌雌二醇受体水平的测定张怀德 桂治宁 卢汉平(核医学教研 室 )周辉楠 曾灿光(分卜瘤法院 )吴乃允乳腺癌组织中,雌激素受体的有或无,可 以预示该肿瘤对 内分泌治疗的反应。据报道。乳腺癌雌激素受体阳性病人约 2 3/ 可 望从 内分泌治疗中得到客观上的缓解〔`,,lj 受体含量越高,肿瘤 对 内分泌 治疗反应的机率越大 t ’ J。目前检测肿瘤组织受体的方法有多 种,本文采用一种简便、灵敏的 D C C 法 ( D eXt arn 一coa -t e d C h a r c o a l p r o c e d u r e ) 溅 定 人乳腺癌组织雌二醇受体的含量为临床提供内分泌治疗的依据。并且对实验,1,某些影响因索进行了实验探讨。材 扦 与 方 法一、试剂1.〔3H」雌二醉 上海 原 子 能 研究所产品 , 放射性 比度 4 5 ic /m m ol,放化纯度 肠 %,使用前,以 S e-ph a d e x L H 一 2 0层析纯化后稀释成约 3 x z 07d p m / m l的贮存液,保存于 一 2 0℃冰箱中 ( 溶剂,苯: 乙醇 二 9:1 )o2.T EM 缓冲液 含 1 0 m M T r i s一H C I , 1.s m ME D T A , Z a m M 琉基 乙 醇 ( M e r e a Pt o e t h a n o l ),P H.7 理,置于 4 ℃冰箱备用。3·己烯雌酚 ( D e s ) 意大利产品,用乙醉溶解,加 T EM 液配 成 3 6 卜M ( 含 5 0% 乙 醇 ),于 4 ℃冰箱备用。4.1 % 荀泵糖炭末悬浮液 ( D C C 液 ) 活性炭 1克,葡聚糖T, 。 ( 瑞典产品 ) 0.1克, T E M 液加至 10m l, 搅拌 4 小时,置 4 ℃冰箱备用。二、方法(一 ) 某些 实验 条件或 影响 因素探讨( 1 )竟争抑制剂 D e s 浓 度的选择胞浆液 0.2m l, ”H 一 E : 2.s n M,加不 同浓度 ( 0.0 0 2 9一 9.3 1 6n M )的 D es 液后置于 4 ℃冰箱平衡过夜,然后加 0.5 % n CC 液 0.峨m l,置于 4 ℃下不时摇动,1 5分钟后,低速 ( 4 ℃)离心 10 分钟,测量上清液娜明步性,以各管加有不同浓度 D es 液的特异结合量 ( B一N S B ),占最大特异结合量 ( B广N S B ) 的%为纵座标,对 D es液的对数浓度作图,求出 5 0%抑制浓 度 ( I cs。)。B为加不同浓度 D es 液所测 J廿的结合值。B 。 为 不 加D es 液测得的结合值。N S B 为加 D es 液 终末浓度为 36 件M 时所 测得的结合值。( 2 ) D CC 液农度对游离配体吸附 力的影响实验按 D CC 液的不同浓度分五组,每组对 6 个不同浓度的3 H一E:进 行 吸附试验,每管体积。.7m l( 3 H 一 E : 0.3m l,D C C 液 0.4m l ),吸附 1 5分钟,以下处理与上述相同。( 3 )月包装蛋白浓度讨非特异结 合的影 响实验按蛋白终末浓度分 2 组,每组设三个不同浓度的“ H 一 E ,,每个” H 一 E: 浓度又分设有蛋白管和无蛋白管 ( 用 T EM 液代替 ),加样内容如下 表:有蛋自管`无。 白管{胞浆 (林1 ) D e s (协l )“ H 一 E: (协1 ) T E M (协I )2 0 0 1 0 1 0 01 0 1 0 0 2 0 0加样后,置于 4 ℃平 衡过夜,加 D C C 吸附,低温离心,取其上清液测量放射性。D es 液 10 协 1其 终末浓度为 1.26 卜 M。有蛋白管测得的放射性为总的非特异结合值,无蛋白管为 D C C 液吸 附不全留下的放射性,前者减后者即为“ H 一 E : 对 非受体蛋白的结合值。( 二 )雌二醇受体 .mJ 定方法( 1期包浆液制备 用冷 T EM 液冲洗标本,除 去脂肪,取 组 织 约 l 克,剪 碎 我 于匀浆器,按 l: 8( w / v ) 加冷 T EM 液,匀 浆 器 置 于冰浴中,低速( 约 Z 0 0 0 r pm ) 匀浆 4 一 5 次,每次约 2 0秒,停约2 0秒。匀浆液低温低速离心.10 分钟后,上清液再经 2 8 0。。x s离J今 40 分钟,所得上清液经适当稀释使其蛋白含量在 1 ~ s m g / m l范 围内 即 为 胞 浆 液,蛋 白 定量按L洲r y` s 法 t: 10( 2) 结 合实验 取已层析过的. H一 E : 贮存液所需是,氮气流吹千,少许无水乙醇重新溶解, ,T EM 液稀释至所需浓度为工作液,即加 10 “ 1. H 一 E : 工作液DOI : 10. 13471 /j . cnki . j . sun. yat -sen. univ (med. sci ) . 1988. 0065七2其终末浓度约为 。.3 nM。结合实验设 含H一E : 8个 浓度组,每组设 总 计 数’( T C )、总结合 ( T B ),和非特异结合 ( N S B ) 各 2 管,加样内容见下表:…个“专一”结合部位类型 91[。我们认为以 50 % 抑制浓度的 1 0 0倍 t9 1 ( 即 1.2 6 “ M ) 作为检测 N S B 的竞争抑制齐J的浓度较为适立.它能有效地竞争抑制了受体结合部位。3H 一 E : 胞浆液 D es 液 T E M 液 总体积(林l ) (卜1 ) (林1) (卜 l ) (林1)1 0~ 1 0 0 3 00~ 2 1 0 3 10次。工X1 0~ 1 0 0 2 0 0 1 0 0~ 1 0 3 1 0 I甸二口.0 126闪城C一BT一.肠防忆汉怕。口的拓!目N S B 1 0~ 1 0 0 2 0 0 1 0赞 9 0~ 0 3 1 0pùùùù...六U几U山匀J,幼环1 0“ 1 D es 液,其终末浓度为 1.2 6林M叫.川!州加样后置于 4 ℃冰箱平衡过 夜,除 T C 管 外,各管加 1 % D CC 液 20 0 “ 1,置 4 ℃下不时摇动, 1 5分钟后低速 ( 4 ℃ ) 离,.\L 10 分钟,测量其上清液放射性。( 3 )受体结 合参数的计井 用 S ca ct h ar d 作图法( 当 r 值不符合统律学要求时也用 Wo lf 或双倒数作图法 )t ” 计算受体结合容量及解离常数 ( K d ),以fm OI / m g 蛋 白表示受体结合浓度。“ ) 方法的重 复性考核 用 进 行别的实验刚死亡的 3 只家兔,取其子 宫,剪 碎,充 分 混和后分成四份,置于 一 30 ℃冰箱保存,按上述方法放不同时间测定其 E R 含量。结 果 与 讨 论关于竞争抑制剂 D es 的浓度,文献报道 不一,·我们的实验结果表明,当 D es 浓度在 。.00 2 9~ 1.165“ M范围内变动时,它对“ H 一 E : 与受体结合的 竞 争效应变化显著,> 1.165 卜 M时就不明显 (见图 1 )。因此, D es 浓度必须大于 1.1 65 “ M 才能使受体游离结合部位均被占据。但足,竞争抑制剂的巨大超量也会使受体上非专一部位发生置换。并且人为地产生多一 3 一 2 一 1 0 2 3D es 对数浓度 (卜M )图 1 D es 对数浓度与受体结合率的关系 (3H 一 E :2。s n M, D e s 浓度 0。0 02 9~ 9。31 6林M )结合配体与游离配体的分离是本实验的重要技术步骤。而用作此分离的 D C C 液,不同作者使用的浓度不同,用量也不一致。本文检泌了几种不同浓度的D C C 液对游离3H一 E : 吸附的影响,结果发现,O。2 5~ 2 %的 D C C 液其吸附力没有显著差别 (见表 2 ),在3H 一 E : 浓度低端 ( O.57n M ) 的吸附 力 约 96 %,高端 ( 5。02 nM ) 可达 9 %。然而,在浓度 的 高端,只使仅有 1 %末被吸附,其残留的放射性也大大地超过低端留下的 放射 性 ( 表 3 )。为 了避免过高估计N S B,不宜使用过高浓度的放射 性 配 基。因 为 T B管与 N S B 管的游离配体不是完全相等。表 1 48 例 人 乳 腺 癌 组 织 E R 测 定 结 果例数 E R十E R一浓度范围 f( m oJ /m g 蛋白 ) 又士 S D P 值单 纯 瘤浸润性导管癌其 他 乳 癌0 ~ 87。70 ~ 3 25一20 ~ 2 7。2 320。2 5 土 1 2。644 8。1 5 士 94。7 51 5。85 士 1 3。2>P > 。·>P > 。.2633125合 计 4 8 3 1 1 7胞浆液蛋白浓度一般选择在线性范盯内 ( 配基结合量对胞浆蛋白浓度作图成线性相关的部分 )便可用作受体测定。然而,在我们对 N S B 的来源进行分析时发现,当蛋白浓度在线性范围内的低端 时 N S B 的主要来源是 D C C 液吸附不全,选择在高端浓度 时,则主要来自”H 一 E : 与 非受体蛋白的结合,并随配体浓度的增加而增加 ( 见表 3,4 )。提示胞浆蛋白浓度最好选择在低端, 以减少 N S B 的计算误差。由 于特异结合 是 从 T B 减 N S B 而 得,若 N S B 计 算有误,也直接影响特异结合的准确估计。表 2 不同浓度的D CC液对游离配体吸附效率的比较活性炭浓度( % )3H 一 E : 浓度 ( nM )0。5 7 1。0 8 1。7 1 2。0 6 4。0 4 6 5。0 20。2 50。5 09 6。2 9 6。8 9 8。4 9 7。7 9 9。4 9 8。99 6。0 9 7。1 9 8。4 9 7。6 9 9。5 9 9。09 6。0 9 7。1 9 8。6 9 8。3 99。5 9 9.09 5。5 9 7。6 98。5 9 4。4 99。4 9 9。09 6。9 9 7。7 9 8。6 9 5.3 9 9。4 9 8。9·6 3.相同样品四 次测定结果表明,E R 平均 结 合 容 量为1 2 2.9 士 2 1.s fm o l / m g蛋白,变异系数 ( C V ) 为 1 7.7%,与 B r a u n s b e r g t, J报道 1 6% 近似。在我们检测的 4 8例原发性乳腺癌 中,31 例 E R 阳性 ( 旧性的限界,文献报道不尽 相 同,有以 3 f m ol /rn g蛋白 [ ’ ],s fmo l /m g 蛋 白闲和 l o fmo l /m g蛋 白[ B ]为最低下限者,本文根据`自己的实验 条件,以 ) 10 fmo l/m g蛋白为 E R 阳性 ),阳 性 率 为 6 4.5 8 %,与文献报道大致相同“ ,6 .81。图 Z a、b为 1例乳腺 癌 E R 测定的饱和曲线和 S e a t e h a r d p l o t s 分析,表明被检的受体蛋白对” H一 E : 的结合 具 有高亲和力,低容量的特点,其 K d 值 为 0.1 1 2~ 4.g s n M ( 平均 2.5 2 + 0.0n M )。3 1例 E R阳性者其 E R 容量在 1 0一 3 2弓.2 fmo l /nI g蛋白,其中5 0 fm ol / m g蛋白以 下 者26 例,51 ~ 10fm ol / m g蛋白者 3 例,大 于 l o o f m ol / m g 蛋 白者 仅 2例,E R 容量偏低者多,是否与肿瘤摘出后未能 及时将标本速冻有关,有待今后研究。1。52。0, 1 0 0 0一日、侣̀忽巾眯织尝注:每管反应体积为 0.3m l , 加 D C C 液。.过m l吸附时伺为 15 分钟表 3 非特异结合来源分析 ( 参加反应 的蛋白浓度 4.6 8m g / m l )- 一-~一.一~一一一.~ 一月~~.~ .怡~ ~. .刀 . . . .配体浓度 (n M )非特异性结合 ( e p m )0。3 1 4 1 6 7。小工91 3 9 0 9左76 1 5 7 0 1与非受体蛋白结合共霎呼万D C C液吸附不全1 1 7 4 9 3 8 6 1 3 1 3 03耳一雌二醇浓度 (n 种图 Z a 饱和结合曲线2 1 6 1 0 9 0 2 5 7 1表 4 非特异结合来源分析 ( 参加反应 的蛋 白浓度 1.8 6m g / m l )U卜配体浓度 ( nM )非特异性结合 ( c p m )0。3 1 4 3。6 1 6 7。4 4 94 4 5 2 0 2 2 3 3 9 4与非受体蛋白结合其中D C C液吸附不全2 2 82 1 79 1 2 1 2 6 61 1 1 0 2 1 2 8。一}\:::{\….…}。’`L_、 _ _{飞O`) 下 、口 吕0 0 9 0 0 10 0 0爪夕了综合以上结果提元 对 N S B 的适当控制 ( 包括配体浓度、D C C 液的吸附效率以及胞浆蛋白浓度等 )会对受体参数的计算和实验方法的稳定性有着重要意义。我们也在方法学上曾对实验的重复性进行了检查,图 Z b S e a t c h a r d Pl o t s 分析.6 4·E R 在肿瘤组织类型中的分布见表 1,与李国 民等s1[ 报道相似。B ar n es 等报道 41[,E R 含量随着年龄的增 加 而有增加的趋势,我们的结 果 未 发 现 这 种 相关 ( P >0.4 ),月经未停的患者其肿瘤 E R 含量平均为 2吐.8 2士 57.69 细。】/m g 蛋白,绝经 后 ( 含停经 6 个月 以上者`) 的 E R 含量为 29.01 士 2 8.6 fm OI /m g 蛋白,两者亦无显著差异 ( P > 0.7 )。参 考 文 献〔 1〕 V i h k o R & IS o t a lo.E s t r o s e n R e e e P t o r s a n dP r o g e s t e r o n e R e e e P t o r s i n B r e a s t C a n e e r.A e t ao b s t e t G y n e e o l S a n d S u PP I 1 9 8 1 , 10 1 , 2 9.[ 2〕 L o w r y O H, e t a l.P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t hf o l i n Ph e n o l r e a g e n t.J B i o l C h e m 1 95 1 ,1 9 3 : 26 5。[ 3〕 K i n g R T B, e t a l.oC m Pa r i s o n o f s o lub le o e s t-or g e n a n d P r o g e s t l n er c e P t o r e如 t e n t of irP ma -r y b r e a e t t u m o r f r o m Ja P e n a n d B r i t a i n.E u r-o P J C a n e e r 1 9 7 7 , 1 3 ( 9 ),69 7.〔4〕 B a r n e s D, e t a l.T w o m e t h o d s f o r m e a s u r e m e-n t o f o e s t r a d io l a n d P r o g e s t e r o n e r e e e P t o r s i nh u m a n b r e a s t e a n e e r a n d e o r r e la t i o n w i t h r e s·P o n s e t o t r e a tm e n t.E u r o P J C a n e e r 1 9 7 7 ,1 3 : 1 1 3 3。[ 5〕 B r a u sn b e r g H.F a e t o r s i n f l u e n c i n g t h e e s t im a-t i o n o f e s t or g e n r e e e P t o r s i n h u m a n m a l i g n a-n t b r e a s t t u om sr.E u r o P J C a n e e r 1 9 7 5 , 1 1:4 99.〔6〕 F e H e r t y P, e t a l.o e s t r a d io l r e e e P t o r s i n e a r·e 二n o m a a n d B e n i g n D i s e a s e o f t h e B r e a s t : A ni n v i t or a s s a y.B r i t J aCn e e r 1 9 7 1 , 2 5 , 6 9 7.7[ 〕 邹继超。类固醇受体分析的,方法和应用。中华核医学杂志 1 9 55 , s ( i ):2 1。〔 8〕 李国民,等。乳腺癌雌激素受体与组织形态之间的关系、 军事医学科学院院刊 1 9 8 6 , :5 3 8 80〔幻 周廷冲编著。受体生化药理学。北京:人 民出版社 1 9 8 5 , 8 5一 1 1理。A M e a s u r e m e n t o f E s t r a d i o l R e e e P t o r L ve e l i n H u m a n Br e a s t C a n c e rZ h a n g H u a id e G u i Z h i n i n g L u H a n P i n g W u N a i y u n(D e P a r tm e n t o f N u e l e a r M e d i e i n e )Z h o u H u i n a n Z e n g C a n g u a n g( T u m o r H i s P i t a l )A b s tr a CtT h e b i n d i n g e a Pa e i t y o f e s t r a d i o l r e e e P t o r s ( E R ) i n H u m a n b r e a s te a n e e r w a s e s t im a tde b yt h e m e t h o d o f D C C A s s a y.T h e d e t e e t a b l e r a t e o f E R一 P o s i t i v e t u m o r s n a m e l y e o n t a i n i n g 1 0o r o v e r 1 0 f m o l /m s P r o te i n 15 6 4.5 8% ( 3 1 o u t o f d s t u m o r s ).A r a n g e O f E R e o n c e n t ar t i o n s 15f r o m 0 t o 3 2 5.2 f m o l /m g t i s s u e P r o t e i n.K d v a l u e s a r e f r o m 0.1 1 2 t o 4.9 8 n M ( 1.5 2 士 0.9n M ).I n m o s t o f t u nt o r s ( a b o u t 5 9% ), E R e o n e e n t r a t i o n s a r e b e l o w 5 0 f m o l /m g t i s s ue P r o t e i n·o f t h e 4 8 b r e a s t e a n e e r t e s t e d,E R l e v e l a n d E R一P o s i t i v e r a t e b e tw e e n t h e s im P l e e a r e i n o,m a a n d i n f i l t r a t i n g d u e t e a r e i n o m a h a v e n o o t a t i s t i e a l l y d i fer e n e e ( P ) 0.1 ).T h e re w a s n ol i n e a r e o r r e l a t i o n b e t w e e n E R e o n t e n t a n d a g e s o f P a t i e n t s,a n d t h e E R l e v e l f o r P o s t m a n o P a u s a lp a t i e n t s e o m P a r ed w i t h t h a t o f p r e m a n O P a u s a l P a t i e n t s w a s n o t f o u n d t o b e s i g n i f i e a n t l y d i f f e r e n t.I n a d d i t i o n,t h e s t u d y o f e x P e r i m e n t s o n t h e e ho ie e o f D E S e o n e e n t ar r i o n,a b s or P t i v e e行e·e i e n e y o f D C C s u s P e n s i o n f o r f r e e l i g a n d a n d t h e e o n t r o l o f t h e N S B h a s b e e n d o n e i n o u rl a b o r a t o r y.K e y w o r d s : B r e a ` t e a n e . r Es t r a d主0 1 r e e e p ot r

人乳腺癌雌二醇受体水平的测定

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