【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT-PCR获取大鼠DNA多聚酶β(POLβ)的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒(pAd-polβ)和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad-polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad-polβPCR鉴定含目标条带，Ad-polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表

钟建辉

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第 26 卷 第 6期2 0( )5 年 1 月中山大学学报 (医学科学版 )JO U R N A L O F S U N Y A T一S EN U N I V ESR I T Y (M E D IC A L S C IE N C ES )V o l.26No v,N o 62 00 5腺病毒载体介导的大鼠 D N A 多聚酶 p 重组体的构建及其在 P C 12 细胞中的表达钟建辉’ , ’ ,银 巍’ ,藏林泉` ,江伟健’ ,邱鹏新` ,颜光美’( 中山大学 1.基础医学院药理教研室 ; 2.附属第一医院肾内科,广东 广州 5 1 0 0 80 )摘 要: 【目的」为探讨 D N A 多聚酶 日在神经细胞损伤中的作用与机制,构建其重组腺病毒载体,并在P cl Z 细胞中表达。【方法 IRT一 P C R 获取大鼠 D N A 多聚酶 日(P o L因的编码序列,TA 克隆测序,酶切 P O L p基因并连人穿梭质粒 P A d rT ac k一c M V,电转至含腺病毒 p A dea 可 骨架质粒的大肠杆菌 BJ 51 83。重组腺病毒质粒 (p A d -P ol 日)和 h p ofe cta m i ne 20 0 转染 2 93 细胞,用重组腺病毒感染 P C 12 细胞。【结果」10 个 T A 克隆中有 3个克隆的序列与 GE N E B A N K 中大鼠 P O L日CD N A 序列完全一致,同源重组检测时 30 个克隆中有 8 个含目标条带。D N A序列正确的 P O L日重组腺病毒质粒转染 2 93 细胞后,感染 A d一oP l p 的 2 93 及 P1C 2 细胞荧光显微镜下可见绿色荧光,重组腺病毒 A d一 Pol p p C R 鉴定含 目标条带,A d一 po l日感染 p C 1 2 细胞 We s t e m B lo t 检测到 p O L p 蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠 D N A 多聚酶 p 的腺病毒重组体并在 P1C 2 细胞中表达关键词:D N A 多聚酶 队 腺病毒载体 ; P 1C 2 细胞中图分类号:Qs z 文献标识码:A 文章编号:1 67 2一3 5 5 4 (2 0 0 5 )0 6一0 6 2 2一0 4C o ns t r u e t i o n o f eRc o m b i n a nt A d e n o vi r u s C o n t a iin n g R a t D N A oP ly me r as e p a n dstI Ex P r e s s i o n i n P C 12 C e l l sZ H O N G Ji an一h u i` , 2 , Y I N W e i` , Z A N G L i n一q u a n ’,J I A N G W e i j i a n` ,QIU Pe n g一 x i n’ ,Y A N G u a n g一m e i(1.De P a mrte n t o f P hamra e ology,I〕r e e lin ie al M e d ie al S e h o o l,2.De P a rt m e n t o f Ne Ph or lo g y,hTef ’i r s t A if liat e d H o s p it al,SU N Y at 一 s e n U n iv e o i ty,G u a n g z h o u 5 1 00 80,C h in a)A bs atre t : 【o bj e e it v e l hT e e即 er s s io n o f r a t D N A P o l ym e r a s e 日 w a s u p 一 er g u la et d aft e r t ar n s i e n t 而d旋e eer br 沮 a ert 巧o e elu s io n, u s i n g t he t e e hn i q u e o f flu oers e e n e e d ife ern t i al d i s p l a y er v e 飞e t r皿s e ir p it o n P ol y m e r a s ee h ia n er a e it o n (F D D RT一P C )R.T o de t e mr in ehteor le o f D N A p o ly m e r a s e 日 (Pol p ) in b r a in inju w.A n a de n o v i alrv e e ot r w a s 。 o n s t o e : e d 。 o n t故 n in g 山 e e o d i n g s e q u e n e e 扬 r r a [ D N A p o ly m e ar s e p.【M e t h o d s ] hT e ar t P o z日 。 o d i n gs e q u e n c e w a s e lo n ed to P G E M 一 T E a s严v e e t o f b y RT一 p C R, a nde o浦mre d b y D N A s e q u e n e i n g an ds ubezo n ed in t oshu ilt e p la s m i d p A d T ar e k 一C M V,ht e n l in e a ir z e d a n d t r a n sfe 二e d t o .E c o li (B J5 1 83 )e o n t a in e d a d e n o v iarl ba ek bo n ev e e ot r P A d Ea s y一1.hTe r e e o m b in a n t P la s m id w a s p a e k a g e d a n d a m p il if e d i n H E K 2 9 3 e e l s.PC 1 2 e e l s w e r e i nfee te diw t h hteree o m b in a n t a de n o v iru s e s.【R e s u l ts l S e r e e n in g 1 0 p G E M 一T E a s尹elo n e s ,3elo n e s h a v e n o b a s e C han ge s.E i g h to u t of 3 0 h o m o lo g o u s er e o m b in iato n p la s m i dsha v e t he 土a吧 e t b an d.hTe A d pol日b ere om b in a n t P la s m i d w a sv e成ed b y D N Ao e q L; e n e e a n a lys is.ftAe r i n企 e t e d w i t h A d p o l pade n o v i ur s, s tr o n g 笋e n fl u o er s e e n e e w e er o b s e二 e din H E K 2 9 3 a n d p C 1 2 e e l s u n d e r fl u o r e s e e n e e m i e r o s e o p y·A d pol俘D N A in 2 9 3 e e l s w a s i d e n t谊 e d b y P C R.T hee x P er s s io n Of r a t D N A P o l y m e r a s e 日 inA dp o l日 主nfee t e d P C 1 2 e e l s a er e o n if mred b y im m un o b lo t an al ys i s.[eo n e lu s i o n l Re e o m bin a n t a d e n o v ir al v e e t o sr e o n t a in i n g r a t D N A p o ly m e ar s e p we er e o n s加e t e d an d 战e i e n街e x P er s s e d inP C 12e els.K e y w o r d s : D N A P o l ym e ar s e 日;ade n o v i ur s v e c t o r ; P C 1 2 e e l s—[J S U N Ya t一 s e n U爪 v (Me d S e i),2 0 0 5,2 6 (6 ): 6 2 2 一6 2 5】收稿日期: 2 0 5一06一28基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 3 04 7 2 0 10) ;广东省自然科学基金研究团队项目 ( 0 3 91 9 1)作者简介:钟建辉 ( 19 6 3一),男,湖南双峰人,博士生 ;颜光美 男,教授,导师.E一m al :y gm @ zs .u de -u cnDOI : 10. 13471 /j . cnki . j . sun. yat -sen. univ (med. sci ) . 2005. 0128第 6期 钟建辉,等.腺病毒载体介导的大鼠 D N A 多聚酶 p 重组体的构建及其在 P cl Z 细胞中的表达 6 2 3碱基切除修复中受损碱基切除为碱基切除修复的限速步骤 l[],D N A 多聚酶 日在碱基切除和D N A链缺口填补等过程中发挥作用 2I]。D N A 多聚酶日(D N A po l y m e r a s e b e t a,p O L母)为一单链多肤,相对分子质量 Mr=39 xl os, 是最小的真核细胞 D N A多聚酶 口 }。Lan g等 4[] 检测 90 例肿瘤的 D N A多聚酶 p(P O L团基因,有近 35 %存在突变。P O L俘基因敲除小鼠胚胎的外周和中枢神经系统发育缺陷,以细胞凋亡为特征,出生即死亡 5[]。D N A 多聚酶 p 稳定过表达可使细胞基因突变增加回。我们在用荧光差异显示 R T一 P C R 法克隆和鉴定大鼠脑缺血相关基因时,检测到大鼠脑缺血后 P O L p 显著增加。为进一步研究 P O L p在大鼠脑缺血等过程中的作用,我们以R T一 P C R 法克隆大鼠 P O L p 的C D N A 序列,将其构建至腺病毒载体中,用人胚胎 肾 2 93 细胞 ( H E K2 9 3) 包装和扩增病毒。P C 12 细胞系来自大鼠嗜铬细胞瘤 ( p he o e h r o m o e y t o m a ),为一种研究神经细胞营养,分化,单胺生物合成及蛋白质运输等功能的细胞模型 9[],也是一种重要的探索细胞抗缺氧分子机制等的体外模型 10[]。我们用 D N A 多聚酶 p 重组腺病毒感染 P C 12 细胞,使其一在 P C 12 细胞中过表达。1 材料与方法1.1 材 料逆转录酶为 iG hc。公司产品,T A 克隆试剂盒购自美国 rPo m eg a 公司,引物合成及 D N A 测序在上海博雅公司,腺病毒穿梭载体 p A D rT ac k一 c M v、腺病毒骨架载体 p A de as y 转化的 B SJ 183 菌株 即A d E as ie r C els由美国休斯霍华德医学院及约翰霍普金斯肿瘤中心 oTn g一 C h u ao H e 教授惠赠 ; Cs CI(美国 Si g ma) : 脂质体转染试剂 L i po fe e t a m i n e Z 0 0 0(美国 In v i t r o g e n ) ; 人胚肾 2 )̀ 3 细胞,P e 12 细胞购自上海市中科院细胞库。1 2 栓塞模型制作及脑组织 R N A 提取大鼠大脑中动脉栓塞模型制作参照文献 1[ 11。大鼠大脑中动脉栓塞模型成功 Z h 后,取缺血区脑组织用液氮冷冻,冷冻组织用研钵研磨使成粉末,边研磨边加液氮。粉末及时转移到 rT i oz l 试剂中,激烈震摇使粉末完全溶于试 flJ。于 1 m L rT iz ol 液中加三氯甲烷 0.2 m L,混匀,LZ Oo o x g 4 ℃离心 15m in,沉淀用无 R N ase 的水溶解后纯化。1.3 获取大鼠 oP l日编码区和 oP l p 定向亚克隆入穿梭质粒 p A d rT ac k一 c M v根据 大 鼠 po l p 的C D N A 序 列 ( N M一 17 14 xC D S S二 1 01 5 )设计一对特异性寡核昔酸引物:正向引 物 1P:TA竹 G G T A C c A T G A G c A A A c G c A A G G,反 向引物 P Z:竹 A A G T C G A CT C A C T C C TGT C CTT G G G C T C,分别有 仰n l 和 & “ I 酶切位点。以 Pl 、几 为引物,以缺血侧 m R N A 为模板,采用一步法R T 一CP R 法获取 目的基 因大 鼠 oP lp 的 编码 区。P C R 扩增反应体系: D E P C 水 2 卜L,xZ R T一 P C R 反应缓冲液 25 林 L,m R N A 模板 1 林(L 约 1 此),正义链引物 (1 0 卜mo l f)L p, 1 林L,反义链引物 pZ( 10 林mo U助 1 卜L,R口孙 z酶 1 林L 共 2 管 10 协L。RT一 P C R参数是先 5 0 ℃预变性 3 0 m in , 9 4 ℃ Z m i n ; 9 4 ℃ 4 5s , 5 2 ℃ 4 0 5,7 2 ℃ 1 m i n,4 个循环 : 9 4 ℃变性 4 5s , 5 8 ℃复性 4 55 , 7 2 ℃延伸 1 m in , 2 5 个循环。产物用 10 sfL 琼脂糖电泳,琼脂糖凝胶试剂盒回收oP l p后作 TA 克隆。T A 克隆按 p G E M一 T aEs尹 (美国 rPo m eg a )说明书进行,简述如下:凝胶回收 P C R产物和 p G E M一 T E as y MT,经几 D N A 连接酶室温 l h后,4 ℃连接过夜,转化到感受态细菌 D H S。,涂板培养后,挑取白色克隆 ( 。 互补筛选 )培养 ; 用分子克隆所述碱裂解法抽提质粒后,再用 cE ol IR 酶切鉴定。阳性克隆使用 S p 6 通用引物测序。勒。 I 和骊 I 双酶切腺病毒穿梭质粒 p A d肠 ac k一C M v 和大鼠 oP lp TA 克隆质粒,分别用琼脂糖凝胶试剂盒回收载体与 目的片段,用 几D N A 连接酶于 16 ℃过夜连接。C aC 12法转化到大肠杆菌 D H S 。。转化菌落用引物 1P: T A T G G T A C C A G A G C A A A C G C A A G G C,P n : 气门,A A Grl,C G A C T C A G C C C A AjI T C G C T G A T G G T做 P C R 鉴定。阳性克隆质粒 p A draT ck一C M V一oP l (用甄。 I酶切线形化,10 妙 琼脂糖电泳凝胶回收。1.4 大鼠 n N A 多聚酶 p (po lp ) 腺病毒 p A de a s y重组体的构建用线形化 P A d rT ac k一 C M V 一 oP l日质粒 转化含腺病毒 p A de as y 骨架质粒的大肠杆菌 BJ S 1 8 3 感受态细菌 (电转法 、。含重组质粒的 BJ S 18 3 细菌可在含K an十的 L B 平板上生长形成克隆,挑选 10一巧 个最小的菌落,碱裂解法小量抽提转化克隆菌的质粒D N A,经 8 妙 琼脂糖电泳,根据与 p A dE as y一 1比较分子大小进行初筛,选择分子较大的候选阳性重组体腺病毒质粒 D N A 用 aP d 酶切鉴定后,抽提重组腺病毒质粒转化感受态细菌 D H S。,用引物 lP,P Z测定重组腺病毒质粒 ( p A d一 p丑日)的序列。1.5 重组腺病毒包装、扩增及滴度测定6 24 中山大学学报 (医学科学版 ) 第 26 卷201班取 4 林 g aP d 线性化 的重组腺病毒 ( p A d-p o l p )质粒,用 L sp ofee ta m i n e Z 0 0 0 转染 6 0 %融合的人胚胎肾 2 93 细胞 ( H E K 2 93 ),37 ℃,体积分数 5 %C OZ条件下温育 s h,弃去原培养液,加人含体积分数 1 0%胎牛血清的 D M E M 培养基。培养 Z d 后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,继续培养10 d,将 2 93 细胞自培养瓶内刮下,离心 1 o o xg,5m in,弃上清,P B S 悬浮细胞,反复冻融裂解细胞 4次后,离心 2 2 0x g,5 m ih 取上清,重新感染H E K 29 3 细胞。将病毒储存液按 10 倍比例稀释,取 40 0 卜 L 加至培养在 24 孔板的 H E K 29 3 细胞中,37 ℃培养 4 h,然后换新的培养基继续培养 1 8~24h,于荧光显微镜下计数 G F P 阳性细胞数,计算病毒滴度。1.6 重组腺病毒 p A d 一 op 平 P C R 鉴定 及 其在P C 12 细胞中的过表达取 5 林L 含病毒的上清,加人 10 林L 的蛋白酶 K,5 5 ℃水浴 l h,煮沸 5 m in , 1 o o o Xg 离心 lm in ,取 2 林L 上清以引物 P I,P n 进行 P c n 鉴定。培养 CP 12 细胞的培养皿预先用多聚赖氨酸包被,培养基为含体积分数 5 %胎牛血清和体积分数 10 %马血清的 R P M n 6 40。Pcl Z 细胞传代培养第 2 天,用重组腺病毒 p A d一 p o l p 感染 (M o l= 2 0 ),感染 4 8 h 后,于荧光显微镜下观察。p A d一 oP lb 感染 P c lZ 细胞4 8 h 后弃去培养基,用冷 P B s 洗 z 遍,加 22 0 林L细胞裂解液,静置 5 m in,收集细胞裂解物转移至1.5 m L E P 管中,沸水浴 5 m in , r o o o o Xg 离心 3 05后用 12 留L 的聚丙烯酞胺凝胶电泳。l o v 恒压转印 6 0 m in 至硝酸纤维膜,硝酸纤维膜用 1x T B s 洗5 m in,用封闭液室温封闭 1一 Z h 后,以含 oP lp b 多克隆抗体的新封闭液 4℃孵育 16~ 18 h,l xT sB T 洗5 m in, 3次,二抗 (含 H R P 标记的鼠抗羊 Ig G 和 H R P标记的抗生物素抗体 )室温孵育 1一 Z h,l x BT s T 洗 5m i n,3 次,用 1 0 mL 1x L u m i G L o 室温孵育 一 2 m in ,于暗室用 X 线胶片感光。荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白 ( G即 )表达,(图 I A,B ) ;感染重组腺病毒 p A d一oP 堆 的 P 1C 2 细胞在 4 8n m 激发光下观察到绿色荧光。(图 I )C图 1 p A d 一p ol p 转染,扩增 ( H E 2K 93 细胞 ) 与表达 ( P C 1 2细胞 )F ig·1 T r a n s fe e t io n a n d a l l l P l if e a it o n of A d 一 op l p in 2 93c el ls, e x P r e s s i o n o f A d一 P o l p in P C 1 2 e e lsP a e l 一 d ig e s t e d p A d一 p o lp w a s t r a n s fe e t e d in t o 2 9 3 e e l l s an d G F pe X p r e s s i o n w a s v i s u a l i zed b y fl u o er s e e n e e m i e or s e o p y ( A, x l 0 0).Ad -pol日 infee t e d 2 9 3 e e l l s.lF u o r e s e e n e e 两e or s e o p y of t h e i nfee t e d e e l sw a s p e orf rme d 24 h lat e r,s t r o n g g re e n fl u o r e s e e n e e w er e o bs e二 d (B,又 2 00 ).P C 12 e e l sinfee t e d by A d一 p o l日 ftAe r l晚c t e d for t h二 e d a ysP C 12 e e l l s w e re v i s u a l i z e d u n d e r fl u ores e e n t 俐e ro s e o P y T h e ra t e ofa `王e n o v irus t o p C 12 e e ll s 15 20 : l ( e, x Zo o )2.3 重组腺病毒 rA d一 p ol p P C R 鉴定可见 4 0 0 b p 特异带 (图 2 )。卜n一2 结 果图 2F i g.21:重组腺病毒 PA d一op 堆P c R 鉴定I d e n t in e a 6 o n Of A dPo l p b y P C Rp o l日 p la s m id ; 2 : n e g at i v e e o nt or l ; M : D N A M arke r ; 4 : A d -A d一 p o l p重组腺病毒 rA d一p ol p 感染的 P C 12 细胞的瓶.242.1 重组腺病毒质粒 (p A d一 p ol 囚 的克隆序列与 N C B I G E N E B A N K 中列出的大鼠 po l p 的e D N A 序列 ( N M _ 0 17 14 1 C D S S二10 15 )一致。.2 2 重组腺病毒质粒 (p A d 一p ol 田转染、重组腺病毒扩增及表达W es t e r n b l o t在 Mr=40 xl 03处有条带,而对照 空病毒rA de as y一G F P 感染的 P c 12 细胞样品没有该条带,表明重组腺病毒 rA d一oP 堆 在 P cl Z 细胞 中过表达第 6期 钟建辉,等.腺病毒载体介导的大鼠 D N A 多聚酶 p 重组体的构建及其在 P C 12 细胞中的表达 6 2 5(图 3 )。1 2 3 M 月夕洲x 103Mr=40 双 0,处有条带,而对照空病毒 rA d eas y一 G F P感染的 P C 12 细胞样品没有该条带。表明重组腺病毒 rA d一oP lb 在 P C 12 细胞中表达。正对其功能作进一步研究。参考文献:405劝图 3 重组腺病毒 A d一 p o l p 感染 p `C 1 2 细胞 p o l p 表达F ig·3 E x P r e s s i o n o f P o l p in A d一 P o l p ll l fe e et d P C 12 e e l s明飞 s t e rn b l o t l,2 : A d 一 p o l日: 3: A d 一 gfP ; M: p r o t e i n m ar k er3 讨 论局灶性脑缺血损伤后其基因表达发生明显改变。本课题组用荧光 m R N A 差异显示 R T一P C R 研究脑缺血基因差异表达,检测到大鼠脑缺血时金属蛋白酶组织抑制 3 亚型 (IT M I,一3),D N A 多聚酶 队热休克蛋白 H S 7P O 等表达上调。为进一步研究P O L p 的作用,特构建其表达载体。已有的 P O L p 表达体系大都为稳定转染,腺病毒载体介导的大鼠D N A 多聚酶 p 及其在 P C 12 细胞中的表达尚未见文献报道。与逆转录病毒载体相 比,腺病毒载体能感染分裂期和非分裂期细胞,腺病毒 5 型 (A ds )是实验性基因治疗中常用 的复制不能的腺病毒载体,新的腺病毒载体系统 A d E as y 具有操作较简便等优点。为便于筛选和作序列分析,我们在构建腺病毒载体前,先作 TA 克隆。共挑选 10 个克隆测序,3 个克隆的序列与 G EN E B A N K 中大鼠 P O L日c D N A序列完全一致。3 个克隆有单个碱基改变,分配为1 8 8 9一 a,3 18 9一 a ,9 68c一 g。1个克隆存在两处变化,即49 3a 一 t 和 8 3 9 c 一 t。另 3个克隆有较多突变,较高的突变率可能与没有用高保真 :钩 酶有关。序列正确的穿梭 (Shu t ile)质粒电转人含骨架伪aC k b on e) 质粒的大肠杆菌 B J5 1 8 3声几沈 1 酶切 30 个最小克隆电泳,8个克隆有 .4 s kb 或 3 姚 D N A 带,取其一测序,其 (p A d一 oP lp ) D N A 序列正确。acPl 线性化的重组腺病毒质粒 ( p A d一 p o l p )用 L i po af e t a m i n e Z 0 0 0 包裹后转染 2 93 细胞,经扩增,收集 A d一oP l p 感染P c 1 2。荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白( G F P )表达P C 12 细胞随病毒感染复数 (; n u l ti p l i e i ty o f i旋e ti o n,M O I ) 增加而增多,M O I 为 1 00 时,p C 12 G F p 阳性率达 9 0 %。A d一 P o l b 感染 p C 1 2 作 We s t e r n b lo t 在近〔l」 Fors in a G.Co u n t e r a e t i n g s p o n tane o u s tr a nsfo mra it o n v i ao v e r e x P ers s i o n o fr a t e 一 l im i t in g D N A b a s e e x e i s io n er P a ire n z y m e s 田.C a cr i n o g e n e s i s,2 0 0 1,2 2 (9 ): 1 3 3 5一4 1.[2」 So b o l R W,Par s a d R,E v e n s k i A, e ` 以.T hel ya s e a e t iv i tyo f th e D N A re P a ir p r o t e i n b e t a 一P o l y m e ar s e p or t e e t s ofr mD N A一d ama g e 一 in du e ede yt o t o石 e i t y 田.Na tu re,2 0 0 0,4 0 5(67 8 8 ): 8 0 7一 1 0-[3」 B e a dr W A,Wils o n SH.S t o e t u alr de s i罗 ofa ne uka汀 o it e D N A er P a i r P o ly m e ar s e : D N A p o ly me ar s ebe t a 田.Mu t a t Re s , 2 0 0 0,4 60 (3一 4 ): 2 3 1一4 4.[4 ] I月I l g T,M al tar M,S ra r e e v ie D, e乙以·A D N A Poly me ar s e日mu t a n t for me o lo n e a n e e r e e l s in d u e e s m u t a t io n s 田.P or e N a il A e a d S e i U S A,2 0 0 4,10 1 (1 6 ):6 0 7 4一9.【5〕 s u g o N,Ar a t an i Y,Na g a兹Li m a Y, e t aL Ne o n a t alle ht a li ty 械 habn ormaln e u or g e n e s i s i n m i e e d iefe ie n t i nD N A p o ly m e ar s e 日[刀.E M B O J,2 0 0 0,1 9 (6 ):1 3 97一4 0 4.【6」 C a n it r o t Y,C a p p JP,Pu g e t N, e t 以.D N A p vol me r a s ebe t a o v e er x P r e s s io n s t im u lat e s ht e R a d5 1 一d e p e n d e n th o m o lo g o u s r e e o m b i n at io n i n m a m m山a n e e l s 团.Nu ele ie Ae id s R e s,2 004,3 2 ( ] 7 ):5 1 0 4一 1 2.[7 ] Ca n i t o t Y,C a z a u x C,F ere h e t M, e t 以.Ov erex p re s s io no f D N A p o l ym e r a s e b e t a i n e e l r e s u l t s in a m u t a t o rp h e n o tyPe a ndade erea s eds e n s it iv ity ot a n t ie a n e e rd ru g s 田.Por e N at l A e a d S e i U S A,1 9 9 8,9 5 (2 l ):12 5 8 6一9 0.〔8 ] Be 笔。沙oV,reFehe t M,p h il p P e M, 。 t `.Ev id e n e e o fifn elyt u n e de x p er s s i o n Of D N A P o ly m e r a s e b e t a i n v i v ou s i n g tr a n s g e n i e m i e e 田.F E B S eL t t,2 0 04,5 6 6 (1 一3 ):1 4 7一 5 0.【9 ] M a丙n T F,G五sha n i n R N.P C 1 2c els a s a m o del fors ut d ie s o f r e g滋 a t e d s e e r e t i o n in n e u or n al a n d e n d o e ir n ee els田.Me t ho d s C e l B i o l,2 0 0 3,7 1: 2 6 7一8 6.[10 ] Sp ie e r Z,M ihlo nr D E.O翔ge n s e n s in g in n e uore n -d o e ir n e e e l s a n d o ht e r e e l t y p e s : Ph e o e h or m o e yot ma(P C 1 2 )e els a s a n e x P e ir m e n t a l mode l田.En d o e r P a *h o l,2 0 0 3,14 (4 ): 2 7 7一9 1.1[ l] 藏林泉,银 巍,皮荣标,等.荧光差异显示 CP R 克隆大鼠脑缺血相关基因 KI A A 0 2 8 0 田.中山大学学报 (医学科学版 )2 0 0 4,2 5 ( 2 ) 9 7一 1 0 1.(编辑 黄小延 )

腺病毒载体介导的大鼠DNA 多聚酶β重组体的构建及其在PC12 细胞中的表达

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