【目的】 研究子宫肌瘤与正常子宫肌组织中的基因表达差异，筛选及克隆子宫肌瘤的致病相关基因。【方法】 应用荧光标记的mRNA差异显示技术，比较11例子宫肌瘤及其正常子宫肌组织基因表达的差异，对获得差异片段进行克隆、测序及同源性分析，并对其中5条差异片段在子宫肌瘤及正常子宫肌组织中的表达情况进行RT-PCR分析。【结果】 差异片段NO.3，5，11，12在子宫肌瘤正常及异常组织中的表达均存在差异。其中NO.3差异片段在8例子宫肌瘤组织中有表达，而相应的正常组织中仅2例有表达。NO.5，11，12差异片段在子宫肌瘤中的表达水平高于正常子宫肌组织中的表达水平。【结论】 在子宫肌瘤的发生和发展过程中存在多个基因的表达异常，其中ulap8基因有可能在子宫肌瘤组织中呈特异性的表达，ulap14，ulap25，ulap26基因在子宫肌瘤组织中存在表达差异，推测这些基因有可能与子宫肌瘤的发病有关

李小毛

李田

杨越波

殷恒讳

谭蜀艳

黄曙方

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第 2 6卷 第 6期2 )0( 5年 1 1月中山大学学报 (医学科学版 )J O UR NA L O F S UN Y A T一SE N U N IV E R SI『f y (M E DI CA L S C I E N CE S)\一0 12 6N ov-入t)一62 (刃 5子宫肌瘤致病相关基因的筛选与克隆李小毛’ ,李 田’ ,杨越波’ ,黄曙方’ ,殷恒讳’ ,谭蜀艳3(中山大学 1.附属第三医院妇产科,广东 广州 51 0 6 30 ; 2.附属第一医院血管外科,广东 广州 51 0 8;03.广州市黄埔区中医院,广东 广州 5 10 660 )摘 要: 【目的】研究子宫肌瘤与正常子宫肌组织中的基因表达差异,筛选及克隆子宫肌瘤的致病相关基因。[方法1应用荧光标记的 m R N A 差异显示技术,比较 1 例子宫肌瘤及其正常子宫肌组织基因表达的差异,对获得差异片段进行克隆、测序及同源性分析,并对其中 5 条差异片段在子宫肌瘤及正常子宫肌组织中的表达情况进行 RT一Pc R 分析。[结果 ] 差异片段 N 0.3,5,1 1,12 在子宫肌瘤正常及异常组织中的表达均存在差异。其中N .o 3 差异片段在 8 例子宫肌瘤组织中有表达,而相应的正常组织中仅 2 例有表达。N O.5,1 1,12 差异片段在子宫肌瘤中的表达水平高于正常子宫肌组织中的表达水平。【结论】在子宫肌瘤的发生和发展过程中存在多个基因的表达异常,其中 d aP S基因有可能在子宫肌瘤组织中呈特异性的表达,ul aP 14,沮 aP 25,ul aP 26 基因在子宫肌瘤组织中存在表达差异,推测这些基因有可能与子宫肌瘤的发病有关。关键词:子宫肌瘤 ; 克隆 ; 基因 ; 差异显示中图分类号:R 7 1 4 文献标识码: A 文章编号: 16 7 2一3 5 5 4 (2 0 0 5 )0 6一0 6 8 4一04S e r e e iu n g an d C lo iu n g of Ge n e s R e la t e d t o U t e r ine Le io m y o m aL l X i a o一m a o,lL iT a n,Y A N G Y u e一b o,H U A N G S h u一af n g,Y IN H e n g一h u i,TA N S hu 一y a n( l,De p a rtme n t Of G y n e e o l o盯 an d o bs t e itre s ,hTehT i dr A if lia t e d H o s p it al,S U N Y a t一 s e n U n i v e rs i t y,G u a n ghzo u5 10 6 30,C h in a ;2.D e P a rt m e n t of V e s s e l S u rse w,hTeF i sr t A if lia et d H o s p i tal,S U N Y a t一 s e n U n i v e sr it y,Guan gzho u5 1X() 80,C h i n a ;3.H u an 即urT ad iito nal C h i n e s e M e d ie i n e H o s p it己,G u a n 邵h o u 5 1 0 66(),C h in a )A b stra e t : [o bje e it v e l To s t u d y hte al t e ar t io n s o f g e n e e x p er s s io n b e t w e e n u et ir n e le i o m y o m a it s u e s an dn omr d m yo m e巨u m u t e ir n e it s s u e s ; ot s e er e n an delo n ehte g e n e s er la t e d to u t e ir n e le io m y o m a.[Meht ods 】T o e o m p aerd娥 ern t g e n e s e x p er s s e d in 1 1 u t e ir n e le i o m y o m a it s s u e s a n d n o mr al m yo m e t iru m u t e ir n e it s s u e s by fl u o er s e e n td ife ern it al d is p la y r e v e二 e atrn s e ir p ito n即 l y me r a s e eha i n er a e it o n (F D D一R仰C R ).D ife ern it al l ye x P er s s e d e D N Afra g m e n st w e r e e lo n ed, s e q u e n e e d,an da n al y z e d in o ir g in·A n d ifv e o f d政ren t ial ye x p re s s e d b an ds w e re an al yz ed byR T一p C R.[ Re s ults l hTe e x p res s io n of N 0.3,5,1 1, a nd 1 2eD N A fra g m e n t s i n u te ir n e le i o m y o m a w e re d族 ren it al.N O,3 e D N A fra g m e n t w as e x 碑e s s e d in e ight Of u t e ir n e le io m y o m a it s s u e (8 / 1 0 ),b u t i n two of e o res P o n d in g n o rm alm yo m e t五u m t is s u e.N 0.5,1 1,an d 12eD N A fra gm e n st w e er e x p er s s e d h ig h e r i n u t e ir n e l e io m y o m a it s s u e ht a nm a t e h e d m y o m e巨u m.【C o n e lu s io n ] D u ir n g oc e u er n e e a n d d e v e lo p m e n t of u t e ir n e le i o m y o m a, e x p er s s io n of m o erht ano n e g e n e al et er d i n u t e ir n e m y o m e t ir u m, u l a p s g e n e m a y b e e x Pre s s e d s ePe i al y in u t e irn ele io m y o m a it s s u e.ul a p l 4, ula p 2 5,an dula p 2 6 ge n e s w e er e x p er s s e d h ihge r in u t e ir n e le i o m y o m a t is s u e ht an ma t e he d m y o m e itr u m,itm a y be re la t e d ot ht e d e v e l o p m e n t of u t e ir n e l e i o m y o m a.eK y owrds : ute ir 此 leio叫o m a : e of n e ; ge ne ; d政 ren t ial d is p la y[J S U N Ya t 一 s e n U n i v (Me d S e i ),2 0 5,2 6 (6 ): 6 84 一8 7 ]子宫肌瘤是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤,据国内统计,妇科住院病例中子宫肌瘤的患病率占 3.3% 一 20.5 %,大约 7 0%一80 % 的子宫肌瘤发生于 3 0一 5 0 岁之间 1[]。目前手术切除仍是子宫肌瘤的主要治疗手段 12。寻找在子宫肌瘤发生发展中出现的特异性的基因变化,将有可能为药物治疗的研究收稿日期: 2 0 5一0 7一08基金项目: 广州市科委科研基金资助项目( 2 0 1一J - (兀岭一 01 )作者简介: 李小毛 ( 19 6 2一 ),男,湖南郴州人,硕士,教授.E一n ,` l : t ig erl e e 7 7 7@ 一6 3.e o mDOI : 10. 13471 /j . cnki . j . sun. yat -sen. univ (med. sci ) . 2005. 0142第 6期 李小毛,等.子宫肌瘤致病相关基因的筛选与克隆 6 8 5提供新靶点。实验证实荧光标记 m R N A 差异显示技术可应用于子宫肌瘤的研究中 l3],并已分离出在子宫肌瘤组织中呈低表达的基因片段 l4],现应用该技术对子宫肌瘤组织与正常子宫肌组织之间的基因表达差异状况进行研究,分离在子宫肌瘤组织中呈高表达的基因片段,以期分离到子宫肌瘤的致病相关基因。1 材料和方法1.1 材 料1.1.1 组 织来源 标本来 自 20 2 年 4 月至 2 0 4年 2 月间于我院行手术治疗的子宫肌瘤患者 n例,年龄 3 3一5 6 岁,平均年龄 43.5 岁。每例患者均取手术切除的肌瘤组织及瘤旁正常组织,并经病理检查证实。组织离体后立即在液氮中速冻,并置于-70 ℃冰箱中保存。一 1.2 试 $l] 知2 0 1 R e a g e n t (.一步法总 R N A 提取试剂 ) ( G I B C o一B R L 公司,美国 ),F l u o r o D D a n dH IE R O G L Y P H m R N A P r o if l e K i t ( Be e k m a n 公司,美国 ),S u p e sr e ir p t 逆转录酶 ( G I B C O 公司,美国 ),R N a s e 一 fere D N a s e ( Ro e h e 公司,美 国 ),d N TP、p e E M 一T E a s y 载体、及o R 酶 ( p or me g a 公司,美国 ),E.z.N.A.lPa s m i d M i n i p er p k i t ( Ome g a 公司,美国 ),D N A 片段回收试剂盒 ( QI A G E N 公司,美国 )。1.1.3 仪 器 c eno m yx L R侧 D N A 测序 /差异显示 系统 及 Geno m yx S C伽 荧 光 图象 扫 描 系 统( Be e k m an 公司,美国 )。1.2 方 法1..2 1 组 织 总 R N A 提取及 鉴 定 参 照 T IR oz leR ag ent 试剂盒说明书分别提取子宫肌瘤组织及正常子宫肌组织的总 R N A。用 R Na s e fr e e D N a s e 清除总 R N A 中的 D N A,10 泌 琼脂糖凝胶电泳检测总R N A 质量,紫外分光光度计测定浓度及纯度。总R N A 样品要求完全无降解,月一A ” A/ 珊 1.9一 .2 0。1..2 2 荧光差异显示 引物由 B ec k m an 公司提供,包括 4 个锚定引物 ( 2 2 b p ) A p Z、A p 6、A 7P、A P g,以及 3 个随机引物 ( 2 4 b p ) A R p l 7、A R p 18、A即 1 9。锚定引物 3’端带有荧光素一 4 甲基罗丹明(te tr a m e ht y lhro d a m i n e,T M R )标记,包含 17 个碱基的T : 通用引物序列 ; 随机引物 5`端含有 16 个碱基的M13 通用引物序列。RT一 P C R 反应体系及条件、测序胶 电泳及荧光扫描仪的操作均按照使用说明书提供的方法进行。1..2 3 差异片段的回收及再扩增 用手术刀切取含有明显差异的。 D N A 条带的干胶条,加 50 林L.0 s x T E 缓冲液,37 ℃水浴 l h,使 D N A 从胶中溶到TE 缓冲液中, 一20 ℃保存。将差异片段进行再扩增,反应条件同第一次 P C R 扩增。1..2 4 P C R 产物的克隆 用 D N A 片段凝胶回收试剂盒将扩增产物回收、纯化。在 .E。01 X -L 1 lBu e感受态制备后,将差异片段与 p G E M一 T E as y 载体连接转化,转化后 的细菌进行培养及蓝白斑筛选,挑选阳性克隆,以碱裂解法提取重组质粒,经 cEo R酶切鉴定。1..2 5 测序及 同源性分析 将提取的阳性克隆质粒 D N A 纯化及测序。将每一序列输人 N C BI 文库中用 B LA S T N 的n r及 d b es t数据库分析其同源性。1..2 6 R T 一P C R 半定量检测 将 or 例患者的子宫肌瘤组织及子宫正常组织提取的总 R N A 进行逆转录。按序列分析结果,用 p ir m er p er m ier软件设计差异片段的特定引物 ; 以刀一ac t in 作内部参照物,进行CP R 扩增。P C R 产物经琼脂糖凝胶电泳检测。2 结 果2.1 D D一 C R 显示差异条带子宫肌瘤组织和正常子宫肌组织的c D N A 扩增产物中存在着 3 0一9 0 b p 大小不等的差异片段,从 12 对两两比较的变性胶中,按照 cD N A 条带的灰度比大于 .2 0 或小于 .0 5 确定回收并挑选差异条带 No.2,3,5,1 1,12,13 进行重扩增,其中 No.2,13 条带在正常子宫肌组织中高表达,N .o 3,5,1 1,12条带在子宫肌瘤组织中高表达 (图 l)。.2 2 差异 cD N A 片段的再扩增将选取的 6 条差异条带用 M 13 和竹 通用引物进行二次 P C R 扩增,将扩增产物进行 10 岁L 琼脂糖凝胶电泳观察,见各泳道都没有出现混杂条带,分子大小与显示结果相符。.2 3 c D N A 片段测序及同源性分析将 6 条c D N A 差异条带进行克隆,酶切鉴定,测序及同源性比较。序列测定后采用 lB as t 软件与G en B an k 的数据库序列进行同源性检索,其中差异片段 No.2 为 已知序列 Ho m o s a p i e n s 。 l o n e e e R G1 24 m R N A s e q u e n e e :序列同源性分别为 9 6%,其余的为未知功能的c D N A 序列。6 8 6,},山大学学报 (医学科学版 、 第 26 卷Ab P M N: : 7 1 7 : 7 N 7一: I·7 1:咬艺`j 劲 欲亘侧 . 甲6 0 05 0 0异 其中 N .o 3 差异片段在 8 例子宫肌瘤组织中有表达,而相应的正常组织中仅 2 例有 表达,且表达水平较子宫肌瘤组织中的低,另外 2 例患者中的肌瘤及正常子宫肌组织中均无表达 (图 2) N。.5,1,12 差异片段在绝多数子宫肌瘤组织及正常子宫肌组织中均有表达,且在子宫肌瘤中的表达水平高于正常子宫肌组织中的表达水平 (图 3)M A B C D E F C 卜I JL4 0 0一 户一a c t l n~ N r , 3阅口卜 N O.5I弓 N 一 尸一 a c t l n一 X ; , 3N o.1 1,图 2F i g·2N o.3 的 R T 一P C R 检测R l,一 P C R I’f S U l tM : l ) N A「1 1 : ,k。· ,( , X 174 I l l n一1`I, g 。 、 t )二o f N o一3、 一 J: 一,。 t一̀· : 一t` 卜 r l一 I , 11、 。 r. J t.一1二1。:] , : , z、 。 J一11 d 二入: l一(, n l 一a l 1l l v` , r一l e t r l u n l t z s s u 护N O.1 2图 l 荧允左开亚小莱 内坏航杖凝服吧不亚小左异条带F ig.l T h e d ifer e n ti a l ly e x P r e s e d c D N A b a n d s s h o w e do n po ly a c r y la m i d e g e l e le e t or Pho r e s is o f n u 一r e s c o n td ifer e n ti a l d i s Pla y入:M : D N人理l l a 赶一kf、 r : N: n , ) n l l a l 1l ly〔) 犷11 e t丙un l t i5 5一 e : I : t 一tt 、 ri rlel e i (jn 一y o n、 a : 7 17: ( l o m l一i n a t i` ) n 。 王 l, ri rl一e r s 护卜 I [一a 《 I护 一 l 亡一t l一J一〔一r〔· 《I 一,一 lr l l二 盆人 P7 a n逐生arl, l t r a l ) r 记· v e 一 s e 一̀ l r一l e r 人 l丈P 17 : 7 18: 〔叹 ) 1 1一I) I n a t l叱, l一,t l , 11 一 t、1s e t s n一a d e o f a n (七or e ( 1 P ir n l e r A I}7 a n ( 1 a r l) i tr ;王叮 n· v 护 [ s t、 l ) r一r l一硬 r气R P】8.B:M : D N A. , l ar k er : N: n o 曰 , 一a ll , , v o r士一e t r i一: .刀 t i、 s tl 〔·: I』: L一r e r i r l .l e io n i y o m a ; 9 17 : c o m bi na t i o n ()f p石me r s e r s n l a d e` )f ar、 (任1一) r e (l 一》 r i r l l硬l rA gPa n ( 1 a r h i tr脚r o v e r s e pir me r八 RP 17 : 9 18 :。·。 )n 一l ) i l l a t i; ,一 。, f 「) r x l r一e rs e t s n l a d e o f a n e ho er d P ir m e r A四a n d ar b i *ar 叮 印 v e sr e 万)ir nl尸 rA R I〕 18 : Fheaorw s i n d i〔一a t e d 一l飞e ba n ds t )f f {ifle 汗n t ial ly护 x l l n· 5 5绝、 (IfD N A fr a盆xl 一e rl主s一 IJ一a c t l n一 N 0 1 }月一a c t ! n一 、 o ! l图 3 N o.1 1 的 R T 一 P C R 检测F ig.3 R T一 P C R r e s u l t o f N o.l lM:r) N A, , , ak, 、以甲 x 174 H ;, , (`11011仁。 、 t ) : A一 J l、 a t i。 : I t’ 、 n t, m L. e rL一t e r 一Il e le l〔 , rl l y 〔】改1一a : N : 了一夏, r n l a lr r l ),叹, r n e [ n u r刀 一is s u 。2.3 R T 一 P C R 检测将 4 条未知功能的,且在子宫肌瘤组织 中呈高表达的差异 片段在子宫肌瘤 中的表达状况进行R『r 一 P C R 半定量验证,发现差异片段 N《 , .3,5,1 1,12 在子宫肌瘤正常及异常组织中的表达均存在差.2 4 新的c D N A 片段提交 CenBa n k将 发现 的 4 条新 的( .D N A 序列 ( N .o 3,5,1 1,12 ) 提交 Ge n B a n k,并已获取序列号 N。, 3J荞列 号为 A B 17 5 s g o,基 因名称u la p s,定位 于 5号染色体 ; N .o 5 序列号为 A 1B 7 5 8 9 2,基 因名称ul ap l4,定位 于 1 号 染 色体 ; N(,.1 1 序 列 号为A B 17 5 s 9 3,基因名称u l a p 2 5,未 知来源; N〔 ,.1 2序列号为 A B 1 7 5 8 91,基因名称u lal, 26,定位于染色体 l p Z I.l 一 2 1.3。第 6期 李小毛,等.子宫肌瘤致病相关基因的筛选与克隆 6 873 讨 论研究表明子宫肌瘤的发生发展受体内多种因素影响,包括雌、孕激素及其受体,各种生长因子及其受体等,随着分子生物学技术的发展,发现细胞凋亡相关基因及抑癌基因图等与子宫肌瘤的发生及发展存在相关性,但在子宫肌瘤发生发展过程中,仍有许多基因变化需要进行深人的研究。m R N A 差 异 显 示 技 术 ( m R N A d i fer e n ti a ld i s p l a y,m R N A D D )是 19 9 2 年 L ia n g 等 [司发展 的用于筛选差异表达基因的一种有效的方法,既可 以发现已知基因的表达差异,也可以发现未知基因的差异表达。该项技术具有快速、灵敏度高、重复性好等优点,自问世 以来 已得到广泛应用,在肿瘤 7[,8] 及其他疾病 9[]的病因等方面均检测出有意义的差异表达基因。aP m h cuc i an 等` l0]应用银染法 m R N A差异显示技术对 子宫肌瘤进行研究`发 现 E R G一 l (ae lr yg r o w th r e s p o n s e l )基因 m R N A的浓度在子宫肌瘤组织降低,推测该基因在子宫肌瘤的发生和发展中起了重要的作用。荧光标记的 m R N A 差异显示技术则是基于荧光素用于测序的原理,对原有的 m R N A差异显示技术进行改进,可直接在荧光扫描仪上确定差异条带。本研究表明应用荧光标记的 m R N A 差异显示技术可进行子宫肌瘤致病相关基因的筛选 3[]。实验研究发现在子宫肌瘤组织中呈低表达的 NO.2 差异片 段 与 G C R G l l4 基 因 序 列 同 源性 达 % %,eG nB an k 检索 已 知 G C R G l l4 基 因 序列定位于6 p 2.3,是王刚石等在进行人胃癌低表达c D N A 片段筛选的研究中发现,功能仍不清。研究已证实G C R lG l4 基因在子宫肌瘤组织及正常子宫肌组织中均可以有表达,且子宫肌瘤中的表达水平低于正常子宫肌组织中的表达水平,表明该基因与子宫肌瘤的发病有关冈,有可能在抑制正常子宫肌细胞向子宫肌瘤细胞转化的过程中发挥作用。本实验进一步研究在子宫肌瘤组 织中呈高表达的 4 条新的e D N A 序列 ( No.3,5,1 1,12 ),在 Ge n B a n k 获取的序列 号 分 别 为 A B 17 5 8 9 0、 z气B 17 5 8 9 2、A B 1 7 5 8 9 3、A B1 75 89 1,在差异显示及 R T一 P C R 实验中均证实这 4 条基因片段在子宫肌瘤中均呈现高表达状况。其中定位于 5 号染色体的u l叩 8 基因在 8 例 ( 8/ 1 0)子宫肌瘤组织中有表达,而相应的正常组织中仅 2例 ( 2/ 10) 有表达,且表达水平较子宫肌瘤组织中的低,推测该基因有可能在子宫肌瘤组织中呈特异性的表达,而子宫肌瘤是良性肿瘤,其特异性表达的基因并不多见,该基因的深人研究将有可能为子宫肌瘤的发病机制提供新的线索。 u l a p l 4, u l a p 2 5,ul ap 26 基因在子宫肌瘤及相应正常子宫肌组织中均可 以有表达,且子宫肌瘤组织中的表达量较高,故推测这些基因有可能与子宫肌瘤的发病有关,其基因功能的变化可能是子宫肌瘤众多发病因素中的某个环节或是病变的结果,其具体功能尚需进一步研究。参考文献:l[] 王世间.子宫肌瘤〔M].第 2 版.北京:人民卫生出版社,2 0 0 0.1一 3.z[] 李小毛,范建辉,侯红瑛,等.腹式子宫切除术的临床评价 !J].中国现代手术学杂志,2 0 0 0,4 ( 2 ): 1 3 2礴-3[] 李小毛,李 田,殷恒讳.应用荧光标记信使核糖核酸差异显示技术分离子宫肌瘤相关基因片段 田.新医学,2 0 0 3,3 4 (8 ): 4 7 2一4[] 李 田,李小毛,殷恒讳,等.子宫肌瘤致病相关基因的初步研究 [J l.癌症,2 0 0 4,2 3 (3 ): 2 9 2一 5.[5】 D e n s e h la g D,B e t t e n dorf H,Wa t e mra n nD, 。 t 以.Polyn l o r p h is r l l of t he p 5 3 tu m o r s u P p r e s s o r 罗n e 15a s s o e i a t e d 、、 i t h s u s e e p巨b ili ty t o u t e ir n e le i o m y o m a 田·Fe rt i l S t e ir l,2 0 0 5,8 4 (1 ): 1 6 2一6.【6 ] b a n g p,p : 、r de e A B.D政 ren t i al d i s p la y o f e u k a仃 o t iem e s s e n g e r l又N A b y m e a n s o f ht e p o l y m e ra s e e h a inrea e t io n [J 〕.Se ie n e e,19 9 2,2 5 7 (5 0 7 2 ):9 6 7一7 1.【7 1 F i s e h e r H,C he n J,S ko o g L, e t 以.C yelin D Ze x p r e s s l o n l : : fa m il i滋 a n d s p o ar d i e b er a s t e ane e r[刀·On e ol Re p.2 0 0 2,9 (6 ): 1 15 7一6 1.18 } Ma e n g HY,C h o i D K,aT ke u eh i M, e才己.A p p e a ar n e e 可o s t e o n e e t i n一 。 x p res s i n g if b or b la s t i e e e ls in e a rl yr a ts t o m a e he a r e i n o g e n e s is a n ds t o m a e h tu m o玲 i n du e edw i t h N一m e t生l y l一N’ 一 n i tr o一-Nn iotrs o g u a n i d in eJ[ ].Jp n JCa n e e rRe s.2 0 0 2,9 3 (9 ): 9 6 0一7.9I[ 减林泉,银 巍,皮荣标,等.荧光差异显示 P C R 克隆大鼠脑缺血相关基因 KI A A 0 2 80 田.中山大学学报 (医学科学版 ),2 0以,2 5 (2 ): 97一 1 0 1.【1 0 ] P a n l b u e e i a n C A,o p er a G M,压ka t u a D J R e d u e e de x p er s s i o n o f e a lr g or wt h ers P o n s e 一 1 g e n e inle io m y o m a a s 记e n成ed b y m m a d政 ern it al d i s p l a y l刀·G yn e e o l O n e o l,2 0 0 2,8 4 (3 ):4 3 1一6.(编辑 张恩健 )

子宫肌瘤致病相关基因的筛选与克隆

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子宫肌瘤致病相关基因的筛选与克隆

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