【目的】 探讨胃癌细胞株和胃癌组织是否有瘦素和瘦素受体表达,以及瘦素对胃癌细胞株的增殖作用?【方法】免疫组化和RT-PCR检测胃癌细胞株及胃癌组织中瘦素和瘦素受体表达,MTT法测定瘦素对胃癌细胞株SGC7901?MGC803?MKN45的增殖作用?【结果】 胃癌细胞株SGC7901?MGC803及MKN45均有瘦素及瘦素受体表达;47例胃癌组织石蜡切片标本检测有瘦素表达20例,有瘦素受体表达23例,两者共同表达17例;19例新鲜胃癌组织标本,有瘦素mRNA表达13例,瘦素受体mRNA表达12例,两者共同表达10例;与对照组相比,100 ng/mL的瘦素可使胃癌细胞株SGC7901? MGC803?MKN45的增殖率分别为1.45?1.56及1.54?【结论】胃癌细胞株及胃癌组织普遍存在瘦素和瘦素受体表达,瘦素可促进胃癌细胞株增殖

赵晓龙

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瘦素及瘦素受体在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达赵晓龙! 朱兆华! 黄开红! 程树红"中山大学附属第二医院消化科! 广东 广州 #$%$&%’摘 要! (目的) 探讨胃癌细胞株和胃癌组织是否有瘦素和瘦素受体表达!以及瘦素对胃癌细胞株的增殖作用* (方法+免疫组化和 ,-./0, 检测胃癌细胞株及胃癌组织中瘦素和瘦素受体表达" 1-- 法测定瘦素对胃癌细胞株 23045%$61307%8619:;# 的增殖作用*<结果+ 胃癌细胞株 23045%$61307%8 及 19:;# 均有瘦素及瘦素受体表达= ;4 例胃癌组织石蜡切片标本检测有瘦素表达 &% 例" 有瘦素受体表达 &8 例" 两者共同表达 $4 例= $5例新鲜胃癌组织标本! 有瘦素 >,:? 表达 $8 例! 瘦素受体 >,:? 表达 $& 例! 两者共同表达 $% 例= 与对照组相比! $%% @A B >C 的瘦素可使胃癌细胞株 23045%$6 1307%86 19:;# 的增殖率分别为 $D ;#6 $D #E 及 $D #;* <结论)胃癌细胞株及胃癌组织普遍存在瘦素和瘦素受体表达!瘦素可促进胃癌细胞株增殖*关键词!瘦素= 瘦素受体= 胃癌中图分类号!"#$%& ’() 文献标识码!* 文章编号!$E4&.8##; #&%%; $ %8.%&;5.%;FGHIJKKLM@ MN C JHOL@ P@Q C JHOL@ ,JRJHOMI L@ 3PKOILR 0P@RJI 0JSS C L@J P@Q3PKOILR 0P@RJI - LKKTJUV?W XLPM.SM@A" UVY UZPM.ZTP! VY?:3 9PL.ZM@A! 0VF:3 2ZT.ZM@A%[JHPIO>J@O MN 3PKOIMJ@OJISMA\" -ZJ 2JRM@Q ?NNLSLPOJQ VMKHLOPS! 2Y: ]PO.KJ@ Y@L^JIKLO\" 3TP@A_ZMT #$%$&%" 0ZL@P&?‘KOIPRO! <W‘aJROL^J) -M L@^JKOLAPOJ OZJ JGHIJKKLM@ MN OZJ SJHOL@ P@Q SJHOL@ IJRJHOMI L@ APKOILR RP@!RJI RJSS SL@J P@Q APKOILR RP@RJI OLKKTJ P@Q OZJ HIMSLNJIPOL^J JNNJRO MN SJHOL@ L@ APKOILR RP@RJI RJSS SL@JD<1JOZMQK) -ZJ JGHIJKKLM@ MN SJHOL@ P@Q SJHOL@ IJRJHOMI bPK QJOJROJQ bLOZ OZJ L>>T@MZLKOMRZJ>LKOI\P@Q ,-./0, IJKHJROL^JS\D -ZJ HIMSLNJIPOL^J JNNJRO MN SJHOL@ bPK L@^JKOLAPOJQ bLOZ 1-- PKKP\D<,JKTSOK) CJHOL@ P@Q SJHOL@ IJRJHOMI bJIJ JGHIJKKJQ L@ APKOILR RP@RJI RJSS SL@J P@Q APKOILR RP@RJI OLK!KTJD ?>M@A ;4 HPIPNNL@ KJROLM@ KHJRL>J@ &% KHJRL>J@ JGHIJKKJQ SJHOL@ " &8 KHJRL>J@ JGHIJKKJQ SJH!OL@ IJRJHOMI P@Q $4 KHJRL>J@ JGHIJKKJQ ‘MOZ MN OZJ> OZIMTAZ L>>T@MZLKOMRZJ>LRPS KOPL@L@AD ?>M@A$5 NIJKZ APKOILR RP@RJI KHJRL>J@" $8 KHJRL>J@ JGHIJKKJQ SJHOL@ >,:?" $& KHJRL>J@ JGHIJKKJQ SJHOL@IJRJHOMI >,:? 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SJHOL@= SJHOL@ IJRJHOMI= APKOILR RP@RJI’ c 2Y: ]PO.KJ@ Y@L^ "1JQ 2RLd!&%%;!&#"8de&#& f &## (第 &# 卷 第 8 期&%%; 年 # 月gMSD &# :MD 81P\ &%%;中山大学学报 % 医学科学版 $cWY,:?C Wh 2Y: ]?-.2F: Y:igF,2i-] %1F[i0?C 20iF:0F2 $收稿日期!&%%8.$%.&%作者简介!赵晓龙j$54# f d!男!浙江诸暨人!博士生!医师 D F.>PLSeGLPMSM@A_ZPMk $E8D RM>瘦素 "SJHOL@d 是机体调节体重的重要物质! 近年来流行病学调查和基础研究证实瘦素与肿瘤的发生密切相关 ’ $" & (* 胃癌组织是否有瘦素及瘦素受体的表达是认识瘦素参与胃癌发病机制的基础!目DOI:10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2004.0067实验组 !"#$对照组 !"%$前国内外尚未见文献报道&本研究检测胃癌细胞株及胃癌组织是否有瘦素及瘦素受体的表达&并观察瘦素对胃癌细胞株增殖的影响&为人们认识瘦素可能作为一种新的生长因子参与胃癌的发病机制提供依据’! 材料与方法!" ! 材 料() 例 石 蜡 切 片 标 本 来 源 于 *%%+ 年 *$ 月 至*%%% 年 *$ 月在广州中山医科大学附属第二医院行胃癌手术切除的病例&低分化腺癌 *, 例&印戒细胞癌 ) 例&黏液腺癌 $ 例&未分化癌和单纯癌 , 例&管状腺癌 *$ 例’ *% 例新鲜胃癌组织标本来源于$--. 年 * 月至 $--. 年 *- 月在该院行胃癌手术切除标本& 取材后迅速放入液氮中& 后转移至 / 0-1冰箱备用& 术后病理证实为管状腺癌 + 例& 低分化腺癌 0 例&未分化癌 . 例&印戒细胞癌 $ 例&黏液腺癌 * 例’以来源于大网膜正常脂肪组织作为阳性对照’ 胃癌细胞株 234)%-*5634,-. 及 678(9 由本科消化研究室保存’!# $ 细胞培养人胃 癌细胞 株 234)%-*5 634,-. 及 678(9用体积分数 *-: 胎牛血清的 ;<6=*+(- 培养基在.) > 5体积分数 9: 4?$ 条件下常规培养@*A . 免疫组化石蜡切片标本经常规脱腊5 水化后& 用柠檬酸盐缓冲液高压锅法抗原修复 * BCD& 细胞标本经常规细胞铺片后用体积分数为 ": 的多聚甲醛固定&链霉菌抗生物素蛋白E生物素E过氧化物酶免疫组化染色超敏两步法 F试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司& 试剂编号 GCHI%0-%& GCH / %0*-J检测瘦素及其瘦素受体的表达&具体操作按试剂说明书进行 K 一 抗 为 兔 抗 人 瘦 素 多 克 隆 抗 体 ?LF! / $-JF2MDHM 4NOP 公司J和山羊抗人瘦素受体多克隆抗体?LI; !6I*, " ! 2MDHM 4NOP 公司 " &抗体稀释度均为 *Q9-&以 <R2 代替一抗做阴性对照K*A ( ;SI<4;按 SNCPTUF3CLVTJ 说 明 书 操 作 提 取 胃 癌 组 织;8!&取 9 WX ;8! 用 66YZ 逆转录酶F<NTB[XMJ逆转录成 V\8!&在 $9 WY 反应体系中分别加入 9 ] ^WY 的 Y! SM_ 酶 -A $9 WY# $ ‘ 缓冲液 *$A 9 WY&( ‘a8S< 混合物 F各 *- BBTU ^ YJ * WY& 模板 \8! *WY&引物各 -A $9 WY# 灭菌蒸馏水 %A )9 WYK<4; 反应条件b#( >变性 .- c&99 >退火 .- c&)$ >延伸(9 c& 最后 )$ > 终止 9 BCD& (- 循环& 3!<\d 作内参照&<4; 产物 $ WY 经 $ X ^ BY 琼脂糖凝胶电泳检测K 引物由上海生工合成&序列参照文献 $ " % &引物序列如下b Y[eHCD 特异性引物上游引物为 fgI44!!3! S33 !44 !3! 4!4 S3I.g # 下 游 引 物 为 fgI344 !44 !44 S4S 3S3 3!3 S!I.g# 扩增片段为$$- Leh Y[eHCD N[V[eHTN 特异性引物上游引物为 fgISS3 S34 4!3 S!! SS! SSS 44S 4SSI.g# 下游引物为 fgI4S3 !S4 !34 3S3 343 S!S SSI.g# 扩增片段为 "., Le& 内参照 3!<\d 特异上游引物为 fgI33S 433 !3S 4!! 433 !SS S33 S43I.g# 下游引物为 fgI44S 443 !43 44S 34S S4! 44! !I.g#扩增片段为 0,$ LeK!# % &’’ 细胞增殖实验以 2340%-*5 634,-. 及 678"f 为研究对象&参照 2ViD[Ca[N 等 $ " % 方法&取对数生长期细胞&胰酶消化后混匀& 用体积分数为 *-: 胎牛血清的 ;<!6=*j(- 调整细胞浓度为 $A f ‘ *-f ^ BY& 接种于 %j孔细胞培养板中& 每孔 $-- WY& 培养 *$ i 后& 换为-A f X ^ BY 牛血清白蛋白的 dMDGc 液培养 *$ i 细胞同步后加入瘦素K 设 $ 个瘦素浓度组 F*- DX ^ BY5*-- DX ^ BYJ# 以不加瘦素组作为空白对照组& 每组设 , 个复孔K 培养 *$ i 后终止实验&每孔加入 6SSFf BX ^ BYJ$- WY&在温箱继续孵育 ( i# 弃上清液&加入二甲基亚砜 *f- WY& 振荡 *- BCD&在酶联免疫检 测 仪 上 选 择 (%$ DB 波 长 测 定 各 孔 光 吸 收 值F !(%$J&以空白孔调零K按下述公式计算细胞增殖率FeNTUCk[NMHCTD NMH[&<;Jb增殖率F<;J l ‘ *--:!# ( 统计学处理结果用均数 m n c 表示&数据用 2<22*-A - 统计软件处理& 组间比较用方差分析& 各组之间两两比较用 Y2\ 方法K" 结 果$# ! 免疫组化胃癌细胞株 2340%-*5 634,-. 及 678(9 均有瘦素及瘦素受体的表达& 瘦素及瘦素受体以胞浆表达为主& (0 例胃癌组织石蜡切片标本中&有瘦素表达 $% 例Fj$: J&瘦素受体表达 $. 例 !(%: "&瘦素及瘦素受体均表达有 *0 例!.j: "# 见图 *# 表 *K中山大学学报 ! 医学科学版 " 第 $9 卷!"#赵晓龙!等 " 瘦素及瘦素受体在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达#$%&’(’)* %*+,图 ! 胃癌细胞株及胃癌组织瘦素及瘦素受体表达的"#$%&" 分析-.)/ 0 123451 $6$(*7.7 ’8 (,+%.6 $69 (,+%.6 :,;,+%’:.6 )$7%:.; ;$6;,: ;,(( (.6, $69 )$7%:.; ;$6;,: %.77<, ! = ) > ?@$)$:’7, ,(,;%:’+&’:,7.7 !@$6, A" BCDEF# @$6, =" BG5HIJ# @$6, J" KG5LMIA# @$6, N"@’O +’’:(* 9.88,:,6%.$%,9 ;$:;.6’?$# @$6, F" P69.88,:,6%.$%,9 ;$:;.6’!?$# @$6, Q" K.)6,% :.6) ;,(( ;$:;.6’?$# @$6, LR 2<S<($: ;$:;.6’?$ #@$6, H " T$% ;’6%:’(U+’7.%.V, ;’6%:’(W图 ’ 胃癌组织瘦素及瘦素受体免疫组化检测()*+ ’ ,--./01)230415-)467 586-)/63)0/ 09 75:3)/ 6/; 75:3)/ <545:30< )/ 1.-6/ *623<)4 46<4)/0-6X" @,+%.6 +’7.%.V, 7%$.6.6) ’8 )$7%:.; +’’:(* 9.88,:,6%.$%,9 $9,6’;$:;.6’?$ $ Y =II ! 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Z \" @,+%.6 :,;,+%’: +’7.%.V, 7%$.6.6) ’8 )$7%:.; 7.)6%3:.6) ;,((;$:;.6’?$ $ Y NII !2<S<($: $9,6’;$:;.6’?$@’O +’’:(* 9.88,:,6%.$%,9 ;$:;.6’?$P69.88,:,6%.$%,9 ;$:;.6’?$K.)6,% :.6) ;,(( ;$:;.6’?$B<;<7 $9,6’;$:;.6’?$2’%$(DA=AHHL=NL]S ^LMN_I=J]S1 ^AIA=F=I=MIS ^ ]S1^QQJ=IALDQLJ=AAM]S ^QNA=IAJ]S1 ^QJA=IA=IS^]S1^Q=I=IAI‘??<6’&.7%’;&,?.7%:* 123451表 A 免疫组化及 123451 检测瘦素及瘦素受体在胃癌组织的表达2$S(,A 2&, ,a+:,77.’6 ’8 (,+%.6$]S ! $69 (,+%.6 :,;,+%’:$]S1! .6 )$7%:.; ;$:;.6’?$ O.%& .??<6’&.7%’;&,?.7%:* $69 123451 6=/ = 123451胃癌细胞株 KG5LMIAbBG5HIJ 及 BCDNF 均有瘦素及瘦素受体的 ?1DX 表达# AM 例新鲜胃癌组织中c有瘦素 ?1DX 表达 AJ 例UQHd W!有瘦素受体 ?1DX 表达 e0 例 UQJd W! 瘦素及瘦素受体?1DX 共同表达 ef 例U0ed Wc见图 0c表 eg0h J =## 细胞增殖实验瘦素对胃癌细胞株的增殖可见到明显的剂量依赖效应U 4 i fh feW!瘦素浓度为 eff 6) j ?@ 时其增殖效应最大% 见表 0k! 讨 论美国癌症协会流行病学的调查显示R 男性中由胃癌所致的死亡可观察到体重指数较高者发生危险升高的显著趋势 & e ’! 而肥胖患者中普遍为高瘦素血清水平k 胃组织也是瘦素的来源之一!瘦素可促进胃溃疡黏膜的愈合 & F ’! 幽门螺旋杆菌$l4! 感染被世界卫生组织定为胃癌发生的m类危 险 因 子c l4 感 染 可 使 胃 黏 膜 瘦 素 蛋 白 及 其第 _ 期 !"#!"#$%日文我校医科 &’’( 年喜获 )’ 项教育部提名国家科学技术奖随着国家科技奖励制度改革*原教育部科学技术奖更名为教育部提名国家科学技术奖*该奖只设一+二等奖, &’’( 年教育部提名国家科学技术奖评审结果已揭晓* 中山大学医科共有 -’ 个项目获奖* 其中有 . 个项目获一等奖* 是历年来获教育部科学技术一等奖项目最多的一年, 基础医学院吴伟康教授等人完成的 /四逆汤抗心肌缺血的作用及其机制研究0+ 一院陈 湖教授等人完成的 /幽门螺杆菌疫苗的实验研究0+沈靖南教授等人完成的 /恶性骨肿瘤的三结合诊断+保肢治疗和基础研究0+陈规划教授等人完成的 /原位肝脏移植的系列研究0+ 二院黄绍良教授等人完成的 /脐血造血干细胞移植的基础和临床系列研究0+眼科中心文峰副研究员等人完成的 /脉络膜相关疾病眼底形态学系列研究0 分别荣获一等奖* 一院叶任高教授等人完成的 /腹膜转运与防御机制的研究0+ 二院程桦教授等人完成的 /瘦素基因+ 瘦素+ 瘦素受体的研究0+ 眼科中心吴德正教授等人完成的/视觉运动觉系列检测方法的建立及其临床应用0+林跃生教授等人完成的 /角膜移植免疫排斥反应的系列防治研究0分别荣获二等奖,! 医学科学处成果专刊科 "表 & 122 法测定不同浓度瘦素对人胃癌细胞株增殖指数的影响23456 & 789:;< =9 5:%<>? =? %"=@A9:"B<A=C "B<: ! DE " AC FBG<"A; ;BC;:" ;:55 5AC: <H"=$FH IJJ BGGBK ! C L MNOPQRST- IPQM’( IUVWX- " Q=Y%B"6Z [><\ ;=C<"=5* D ] T^ T-# & " Q=Y%B"6_ [><\ 56%<>C -T C‘ a Yb ‘"=$%$ D ] T^ T-YEVc 表达增加*清除 dD 后瘦素表达减少 % . &*因此瘦素可能与胃癌发生有关,探究胃癌细胞株及组织是否有瘦素及瘦素受体的表达*是认识瘦素参与胃癌发病机制的基础, 我们应用免疫组化及 EJeDQE的方法从蛋白和核酸两个水平证实f胃癌组织及细胞株普遍存在瘦素及瘦素受体的表达* 约 - a ( 的肿瘤同时有瘦素及瘦素受体的表达*但不同的病理类型其瘦素及瘦素受体表达的阳性率不一*说明在胃癌组织中瘦素及瘦素受体的表达存在异质性, 在体外瘦素可促进胃癌细胞株的增殖* 胃癌细胞普遍存在瘦素及瘦素受体的表达* 提示瘦素可以自分泌的方式参与了调控胃癌细胞的增殖g 此外经脂肪组织分泌入血的瘦素也可经微循环到达胃癌组织* 说明瘦素也可以内分泌的方式作用于胃癌细胞,参考文献!QB556 7 7$ E=Z">‘$6h Q$ iB5j:" J U $ :< B5^ kl:"![:>‘\<$ =m:G><K$ BC_ Y="<B5><K 8"=Y ;BC;:" >C B %"=G%:;!<>l:5K G<$_>:_ ;=\="< =8 n^ O^ B_$5<G % o & ^ V 7C‘5 o I6_$&TT($ (WM ! )R " ’ ).&Xe(M^dB"_[>;j o Q$ pBC q6C r">Cj P E$ k886"\B$G P o$ 6<B5^ b6%<>C >G B ‘"=[<\ 8B;<=" 8=" ;=5=C>; 6%><\65>B5 ;655G% o & ^ PBG<"=6C<6"=5=‘K* &TT) )&) ! ) " ’ RSeMW^I>s d$ i>_tBtB c$ oBC_5 k$ :< B5^ 7s%":GG>=C =8 5:%<>CBC_ 5:%<>C ":;:%<=" >G=8="YG >C <\: \$YBC G<=YB;\ % o & ^P$<$ &TTT $ WR ! W " ’ WM)e.^O;\C:>_:" E*r="CG<:>C O E$ Q\"=$G=G P D$ :< B5^ b:%!<>C Y:_>B<:G B %"=5>8:"B<>l: ":G%=CG: >C \$YBC ‘BG<">;Y$;=GB ;:55G [><\ 8$C;<>=CB5 ":;:%<=" % o & ^ d="Y I:<BmE:G$ &TT)$ (( ! ) " ’ )e.^U=C<$":j D Q$ r"h=h=[Gj> J$ O$5:j=lB u^ E=5: =8 5:%<>C>C $5;:" \:B5>C‘ % o & ^ 7$" o D\B"YB;=5$ &TT)$ W)W !) " ’MReSR^ch$YB J$ O$<= d$ v<= w$ 6< B5^ PBG<">; 56%<>C BC_ d6!5>;=mB;<6" %K5="> >C86;<>=C % o & ^ P$<$ &’’- $ WS ! ( " ’ (&WeS^! 编辑 黄小延 "! - &x & &x ( &x W &x X &x . &!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!中山大学学报 ! 医学科学版 " 第 &X 卷Q=C<"=5b6%<>C )T C‘ a Ybb6%<>C )TT C‘ a YbcWS&T^ WW y T^ T&T^ XS y T^ T& - "T^ .W y T^ T- - " *& "DE-^ T-z (W-z WXcWS&T^ XT y T^ T(T^ RT y T^ T( - "T^ RM y T^ T& - " *& "DE-^ TT-^ WT-z X.cWS&T^ WM y T^ T-T^ .W y T^ T& - "T^ RW y T^ T& - " *& "DE-^ TT-^ ((-^ XW{简 讯{!"!

瘦素及瘦素受体在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达

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