【目的】探讨瘦素和血管内皮生长因子（VEGF）在子宫内膜异位症（EMs）发病机制中的作用。【方法】应用免疫组织化学法检测瘦素和血管内皮生长因子在28例卵巢子宫内膜异位囊肿患者的异位内膜、在位子宫内膜及20例正常子宫内膜中的表达特点。【结果】①腺上皮细胞中：瘦素和VEGF在异位内膜和在位内膜中的表达均高于正常子宫内膜（P〈0．05），并且异位内膜中的表达高于在位内膜（P〈0．01）；②间质细胞中：瘦素在异位内膜中的表达高于在位内膜、正常子宫内膜（P〈0．01），VEGF在异位内膜、在位内膜及正常子宫内膜中的表达差异无统计学意义（P〉0．05）；异位内膜、在位内膜中的瘦素与VEGF均呈正相关表达（P〈0．01）。【结论】瘦素和血管内皮生长因子在卵巢子宫内膜异位症的发病机制中发挥作用，两者在异位内膜和在位内膜中的血管生成过程中密切相关

余妙真

吴玲玲

李琳

王振花

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收稿日期: 2007-07-05基金项目: 广东省卫生厅名医工程基金( 2004)作者简介: 吴玲玲 ( 1970- ) , 女 , 安徽芜湖人 , 硕士 , 主治医师 , E- mail:wll1990@sohu.com·临床研究·子 宫 内 膜 异 位 症 ( 简 称 内 异 症 , ovarianendometriosis, EMs) 是一种妇科常见病 , 其发病机制尚未明确。多数研究表明 , 逆流至腹腔的子宫内膜经历粘附、侵袭后 , 新生血管形成是进一步生长瘦素和 VEGF 的阳性细胞在卵巢子宫内膜异位症中的病理学研究吴玲玲 1, 余妙真 2, 李 琳 2, 王振花 2( 1. 中山大学附属第三医院妇产科, 广东广州 510630; 2. 中山大学附属第二医院妇产科 , 广东广州 510120 )摘 要 : 【目的】探讨瘦素和血管内皮生长因子(VEGF) 在子宫内膜异位症 ( EMs) 发病机制中的作用。【方法】应用免疫组织化学法检测瘦素和血管内皮生长因子在 28 例卵巢子宫内膜异位囊肿患者的异位内膜、在位子宫内膜及 20 例正常子宫内膜中的表达特点。【结果】①腺上皮细胞中 : 瘦素和 VEGF 在异位内膜和在位内膜中的表达均高于正常子宫内膜(P< 0.05), 并且异位内膜中的表达高于在位内膜(P< 0.01); ②间质细 胞 中 : 瘦 素在异位内膜中的表达高于在位内膜、正常子宫内膜(P< 0.01), VEGF 在异位内膜、在位内膜及正常子宫内膜中的表达差异无统计学意义 ( P >0.05) ; 异 位 内 膜 、在 位 内 膜 中 的 瘦 素 与 VEGF 均 呈 正 相 关 表 达(P< 0.01)。 【结 论 】瘦素和血管内皮生长因子在卵巢子宫内膜异位症的发病机制中发挥作用 , 两者在异位内膜和在位内膜中的血管生成过程中密切相关。关键词 : 子宫内膜异位症 ; 瘦素 ; 血管内皮生长因子 ; 免疫组化中图分类号 : R711 文献标识码 : A 文章编号 : 1672- 3554( 2007) 06- 0674- 04Pathological Study about Positive Cell of Leptin and Vascular Endothelial GrowthFactor in Ovar ian Endometr iosisWU Ling- Ling1, YU Miao- Zhen2, LI Lin2, WANG Zhen- hua2( 1. The Third Affiliated Hospital, SUN Yat- sen University, Guangzhou 510630, China; 2. The Second Affiliated Hospital,SUN Yat- sen University, Guangzhou 510120, China )Abstract: 【Objective】To discuss the pathophysiological role of leptin and vascular endothelial growth factor(VEGF) in endometriosis. 【Methods】 Leptin and VEGF expression were detected in 28 ectopic endometrium,eutopic endometrium, and 20 endometrium of control group by immunohistochemical staining. 【Results】Ectopic andeutopic tissues showed statistically stronger leptin and VEGF expression compared with normal controls (P< 0.05)and ectopic tissues showed statistically stronger leptin and VEGF expression compared with eutopic tissues (P <0.01) in glandular epithelium cells; Ectopic tissues showed statistically stronger leptin expression compared witheutopic tissues, normal controls in stroma cells (P< 0.01). However, we did not find difference about VEGFexpression among ectopic tissues, eutopic tissues, or normal controls in stroma cells(P﹥0.05). Leptin expression waspositively correlated to VEGF expression in ectopic endometrium and eutopic endometrium (P < 0.01).【Conclusions】 Leptin and VEGF play an important role in the progression of endometriosis. There is closerelationship between leptin, VEGF, and endometriotic angiogenesis.Key word: endometriosis; leptin; vascular endothelial growth factor; immunohistochemical staining[J SUN Yat- sen Univ(Med Sci), 2007, 28( 6) :674- 677]第 28 卷 第 6 期2007 年 11 月Vol.28 No.6Nov. 2007中山大学学报(医学科学版)JOURNAL OF SUN YAT-SEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)DOI:10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2007.0148表 1 瘦素在异位内膜、在位内膜及对照组中的表达情况Table 1 Leptin expression in ectopic tissues, eutopic tissues,and normal controlsEctopic endometriumEutopic endometriumFollicular phaseLuteal phaseNormal endometriumFollicular phaseLuteal phase2828199201010-0000000+19721486++915105624+++181)2)41)24)2004)0-2642752+9161061046++11541312+++61)2)13)14)0004)0Glandular epithelium cells Stroma cellsnGroup1) compared with normal controls, P< 0.01; 2) compared witheutopic tissues group, P< 0.01; 3) compared with normal controls, P>0.05; 4)compared with luteal phase group, P >0.05.的必要条件。瘦素由脂肪细胞分泌 , 人体内瘦素浓度与体质量指数(BMI)呈正相关 [1]。Sierra 等 [2]用瘦素处理人脐静脉血管内皮细胞将会引起浓度依赖性的细胞数量增加 , 表现为类似血管早期形态管状物的增加和新生血管的形成。血管内皮生长因子 ( vascular endothelial growth factor, VEGF) 是 一种 特 异 地 作 用 于 血 管 内 皮 细 胞 的 多 功 能 细 胞 因子 , 具有促进微静脉 , 小静脉通透性增加 , 血管内皮细胞分裂、增殖 , 细胞质钙聚集以及诱导新生血管形成等作用。本研究通过检测瘦素和 VEGF 在EMs 患者异位内膜与在位内膜中的表达 , 探讨瘦素和 VEGF 可能在 EMs 发病机制中发挥的作用。1 材料与方法1.1 研究对象研究组 : 28 份异位内膜和在位内膜均取自中山 大 学 附 属 第 二 医 院 妇 产 科 2004 年 12 月～2006年 4 月期间住院手术、经病理确诊的卵巢子宫内膜异位囊肿并且见到完整的腺上皮及间质细胞的患 者 , 且 依 据 1985 年 美 国 生 育 学 会 (AFS)提 出 的“修正子宫内膜异位症分期法”(r- AFS)的评分标准均 为Ⅲ～Ⅳ期 患 者 , 年 龄 23～48( S=35.5) 岁 , BMI( 22.9±1.3) kg/㎡, 在位内膜增生期 19 例, 分泌期 9例。对照组: 同期在该院因浆膜下或肌壁间子宫肌瘤 行 手 术 治 疗 的 子 宫 内 膜 正 常 的 20 例 非 EM 患者, 年龄 30～47( S=37.4) 岁 , BMI ( S=23.3) kg/㎡,其中增生期 10 例, 分泌期 10 例。研究组与对照组患者均为月经规律 , 近 3 个月未用过激素类药物 , 且排除糖尿病、高血压、心脏病、肥胖、子宫内膜癌 ,子宫腺肌病及多囊卵巢综合症(PCOS)等疾病的生育年龄妇女, 两组年龄与 BMI 差异无统计学意义。1.2 方 法1.2.1 标本获取 在手术时取卵巢子宫内膜异位囊肿的囊壁组织、在位内膜组织及正常子宫内膜组织 ( 未行全子宫切除术患者 , 征得知情同意下 ,术中用取内膜器取得子宫内膜 ) , 均以甲醛固定、石蜡包埋, 并经病理检查证实。1.2.2 免 疫 组 织 化 学 检 测 本 研 究 采 用 SABC( strept avidin-biofin complex) 法 免 疫 组 织 化 学 测定 , 瘦 素 多 克 隆 抗 体 、VEGF 多 克 隆 抗 体 均 购 自Santa Cruz 公司。二抗试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。实验步骤参照试剂盒说明书进行。用已知的阳性乳腺癌切片作阳性对照, PBS 代替一抗作阴性对照。1.2.3 结果判定 采用双盲法进行评分 , 每张切片随机观察 10 个有代表意义的高倍视野 , 每个视野计数 100 个细胞中的阳性细胞数 , 取平均数作为结果。判定标准 : 阳性为细胞内出现黄色颗粒。表达阴性和阳性根据细胞染色强度和染色细胞所占面积,即两者积分之和来判断。染色强度分为: 不染色为 0, 轻度染色为 1, 中度染色为 2, 强度染色为 3。染色面积分为: 无细胞染色为 0; < 25%细胞染色为 1; 25%～50%细胞染色为 2; > 50%细胞染色为 3。若积分之和为 0, 则表达阴性( - ); 积分之和为 1～2 则表达弱阳性( + ); 积分之和为 3～4 ,则表 达 阳 性( ++ ); 积 分 之 和 为 5～6 ,则 表 达 强 阳 性( +++ ) 。1.2.4 统 计 学 处 理 数 据 分 析 采 用 SPSS 11.0 统计软件包进行 : 计量资料行 t 检验 ; 计数资料采用秩 和 检 验 ; 瘦 素 和 VEGF 表 达 之 间 的 相 关 性 行Spearman 相关性分析。取 P< 0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 瘦素在异位内膜、在位内膜中的表达腺上皮细胞中 : 异位内膜、在位内膜中的表达均高于正常内膜 ( P< 0.01); 异 位 内 膜 中 表 达 高 于在位内膜( P< 0.01)。间质细胞中: 异位内膜中表达高于在位内膜( P< 0.01)、正常内膜( P< 0.01); 在位内膜与正常内膜之间的表达差异无统计学意义 ( P吴玲玲 , 等. 瘦素和 VEGF 的阳性细胞在卵巢子宫内膜异位症中的病理学研究第 6 期 675>0.05) 。瘦素在 3 组表达情况见表 1, 部分表达见图 1。2.2 VEGF 在异位内膜和在位内膜中的表达腺上皮细胞中 : 异位内膜、在位内膜中的表达均高于正常内膜 ( P< 0.01、< 0.05); 异位内膜中表达高于在位内膜 ( P< 0.01)。间 质 细 胞 中 : 异 位 内膜、在位内膜、正常内膜进行两两比较差异均无统计学意义 ( P >0.05) 。VEGF 在 3 组表达情况见表2, 部分表达见图 2。图 1 瘦素在异位内膜、在位内膜及对照组中的表达图 2 VEGF 在异位内膜、在位内膜及对照组中的表达Fig.1 Leptin expression in ectopic tissues, eutopic tissues, and normal controls (SP ×400)2.3 瘦素、VEGF 在异位内膜、在位内膜中表达的相关性异位内膜中的瘦素与 VEGF 表达 : 在腺上皮细胞中的相关系数 r1=0.846; 间质细胞中的相关系数 r2=0.844 (P 均< 0.001)。在位内膜中的 瘦 素 与VEGF 表 达 : 在 腺 上 皮 细 胞 中 的 相 关 系 数 r3 =0.918; 间 质 细 胞 中 的 相 关 系 数 r4=0.890 (P 均<0.001)。3 讨 论在内异症的病因学研究中 , 大多数学者支持Sampson 学说 , 即子宫内膜种植学说。但不能解释 :约 90%妇女月经来潮时有经血逆流至腹腔 , 却只有 10%发生内异症[3]。因此有学者[4]提出“在位内膜表 2 VEGF 在异位内膜、在位内膜及对照组中的表达情况Table 2 VEGF expression in ectopic tissues, eutopic tissues,and normal controls1) compared with normal controls, P< 0.01; 2) compared withnormal controls, P< 0.05; 3) compared with eutopic tissues group, P<0.01; 4) compared with eutopic tissues group, P >0.05; 5) comparedwith normal controls, P >0.05; 6)compared with luteal phase group, P>0.05Ectopic endometriumEutopic endometriumFollicular phaseLuteal phaseNormal endometriumFollicular phaseLuteal phase2828199201010-0000000+58711385++817116624+++151)3)32)16)2106)1-6844853+13151141055++7541202+++24)5)05)06)0006)0Glandular epithelium cells Stroma cellsnGroup1A 1B 1C2A 2B 2C中山大学学报(医学科学版) 第 28 卷676( 下转第 682 页 to page 682)[1][2][3][4][5]决定论”, 即在位内膜作为异位种植的物质主体 ,在EMs的发生中起着决定性作用 , 这是对 Sampson学说的修正和完善。本 实 验 采 用 免 疫 组 化 的 方 法 研 究 了 瘦 素 在28 例卵巢内异症患者异位内膜、在位内膜的表达 ,发现瘦素在异位内膜腺上皮细胞、间质细胞的表达 均 高 于 对 照 组 内 膜 , 与 Wu 等 [ 5] 的 研 究 结 果 相似 , 提示异位内膜中的瘦素的高表达可能与异位病灶的生长、发展有关 ; 在位内膜腺上皮细胞的表达高于对照组内膜 , 与 Wu 等结果不同 , 但是该学者只是对 4 例在位内膜进行了测定 , 样本量较少。因此我们认为瘦素在在位内膜与正常内膜之间表达的差异 , 提示前者在发生经血逆流后 , 容易发生异位种植 , 从而发生内异症。本研究显示 , 异位内膜腺上皮细胞、间质细胞中瘦素的表达高于在位内膜 , 我们考虑一方面源于腹腔微环境的影响 , 目前的资料表明 , 内异症患者腹腔液中巨噬细胞的数量和活性增加 , 分泌肿瘤坏死因子 α(TNF- α) 等细胞因子升高 , 并有研究 [6]证 明 TNF- α可 促 进 瘦素的分泌 ; 另一方面瘦素在异位内膜间质细胞中的表达增高与瘦素自身的特性有关 , 即瘦素可以激发异位内膜间质细胞瘦素 mRNA 的表达 , 其上调作用呈剂量依赖性 , 且瘦素的这种正反馈作用仅见于异位子宫内膜 , 对在位内膜间质细胞不发生此作用[5] , 因此形成恶性循环 , 进一步促进了异位内膜中瘦素的表达 , 从而促进了内异症的进一步发展。本研究中: VEGF 在异位内膜腺上皮细胞中表达高于对照组 , 差异有统计学意义 , 与王宁宁[7]、徐红 [8]等 的 研 究 结 果 类 似 , 提 示 异 位 内 膜 中 VEGF的过度表达 , 可能使其具有很强的血管生成能力 ,异位内膜得以在异位存活并进一步的侵袭、发展 ,使 病 灶 不 断 地 扩 大 ; 在 位 内 膜 腺 上 皮 细 胞 表 达VEGF 高 于 对 照 组 , 与 徐 红 等 [8]的 报 道 一 致 , 从 在位内膜 VEGF 的促血管生成层面上佐证了 “在位内膜决定论”的观点 ; 但是我们的研究表明异位内膜腺上皮细胞 VEGF 的表达高于在位内膜 , 这一结果与徐红等 [8]不同 , 分析可能与腹腔微环境的影响有关 , 主要是腹腔液中巨噬细胞的作用 , 一方面巨噬细胞自身产生 VEGF[9], 另一方面其分泌的一些细胞因子如 TNF- α等 , 从而通过自分泌或旁分泌机制实现对 VEGF 的上调。瘦素- 受体信号转导主要通过酪 氨 酸 激 酶 信号转导与转录( JAK- STAT) 途径。VEGF 作为一种血管生长因子 , 须与其受体结合后通过酪氨酸激酶传导通路而发挥作用。Suganami 等 [10]在一项瘦素对于局部缺血诱导的视网膜神经血管化的刺激研究中认为 : 其促进作用可能是通过上调视网膜内皮细胞的 VEGF, 并且 VEGF mRNA 升高至少部分是通过激活 STAT3 途径来实现。Kitade 等 [11]通过 大 鼠 试 验 表 明 : 瘦 素 的 促 血 管 生 成 作 用 及 与VEGF 的协同作用在非酒精性肝硬化发展为肝纤维化及肝癌的过程中发挥重要作用 , 并且瘦素通过促进 VEGF 生成发挥血管生成作用。另有学者认为 : 瘦素通过上调 VEGF 的分泌 , 在乳腺癌的发病中发挥重要作用 , 并且抑制瘦素分泌可能成为治 疗 乳 腺 癌 的 研 究 方 向 [12]。 可 见 , 在 一 些 疾 病中 , 瘦 素 的 促 血 管 生 成 作 用 通 过 上 调 VEGF 而实 现 [13]。本研究结果 : 异位内膜、在位内膜中瘦素与 VEGF 的表达均具有正相关性。VEGF 被认为是最重要的血管形成因子 , 因此推论瘦素、VEGF 在在位内膜、异位内膜的血管形成方面可能有密切联系 , 在卵巢内异症的发生发展中 , 瘦素有可能通过促进 VEGF 分泌而发挥促血管生成作用。本 实 验 提 示 异 位 内 膜 、 在 位 内 膜 中 瘦 素 、VEGF 的表达增高可能与卵巢内异症的发病有关 ,并且瘦素、VEGF 在卵巢内异症中的作用可能具有内在的联系。但有关内异症中瘦素、VEGF 的具体作用机制则有待于更进一步的研究 , 而对于瘦素与 VEGF 的深入研究有助于为内异症的治疗提供新的靶点。参考文献 :KENNEDY A, GETTYS T W, WATSON P, et al. 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瘦素和VEGF的阳性细胞在卵巢子宫内膜异位症中的病理学研究

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