【目的】研究发作期哮喘患儿的外周血CD40、CD40L的表达率及其与Tc1和Tc2的关系。【方法】应用流式细胞术检测30例哮喘患儿和20例正常对照儿童的外周血淋巴细胞CD40、CD40L的表达率和Tc1、Tc2的细胞数。【结果】哮喘患儿和正常对照组的外周血淋巴细胞CD40表达率分别为21.59±7.61和15.82±4.44(t=3.376,P0.05);Tc2细胞数分别为7.64±3.67和3.02±1.38(t=3.981,P0.05)。【结论】发作期哮喘患儿存在明显的CD40/CD40L、Tc1/Tc2的异常,这可能与哮喘的发生有重要的关联

刘甜甜

吴葆菁

檀卫平

魏菁

麦贤弟

黄花荣

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收稿日期: 2006-07-20基金项目: 广东省卫生厅基金 ( E002003037) , 中山医科大学中青年科研基金 ( B002001013)作者简介: 黄花荣 ( 1966- ) , 女 , 河南长葛人 , 硕士 , 副教授、副主任医师 , 主要从事儿科呼吸系疾病和免疫性疾病的研究 , Email:hhrvivi@21cn.com小儿哮喘是儿科呼吸道 疾 病 中 常 见 病 之 一 , 发病机制仍未能完全明了 , 其中最主要是免疫异哮喘患儿的外周血淋巴细胞 CD40/CD40L 的表达及其与 Tc1 和 Tc2 的关系黄花荣 1, 刘甜甜 1, 魏 菁 2, 吴葆菁 1, 檀卫平 1, 麦贤弟 1( 中山大学附属第二医院 1. 儿科 , 2. 医学研究中心 , 广东 广州 510120 )摘 要 : 【目的】研究发作期哮喘患儿的外周血 CD40、CD40L 的表达率及其与 Tc1 和 Tc2 的关系。【方法】应用流式细胞术检测 30 例哮喘患儿和 20 例正常对照儿童的外周血淋巴细胞 CD40、CD40L 的表达率和 Tc1、Tc2 的细胞数。【结果】 哮喘患儿和正常对照组的外周血淋巴细胞 CD40 表达率分别为 21.59±7.61 和 15.82±4.44( t=3.376, P< 0.001) ; CD40L 表达率分 别为 0.20±0.11 和 0.33±0.12( t=- 2.747, P< 0.05) ; Tc1 细 胞 数 分 别 为9.06±3.80 和 7.28±3.01 ( t=0.582, P >0.05) ; Tc2 细 胞 数 分 别 为 7.64±3.67 和 3.02±1.38 ( t=3.981, P< 0.001) 。CD40 和 CD40L 表达率与 Tc1、Tc2 数量无显著的相关 性 ( r 分 别 为- 0.004 和 0.231、- 0.280 和 0.186, P >0.05) 。【结论】发作期哮喘患儿存在明显的 CD40/CD40L、Tc1/Tc2 的异常 , 这可能与哮喘的发生有重要的关联。关键词 : 哮喘 ; 白细胞分化抗原 40/40 配体 ; 细胞毒性 T 细胞 ; 淋巴细胞 ; 儿童中图分类号 : R 文献标识码 : A 文章编号 : 1672- 3554( 2007) 01- 0079- 04Expression of CD40/CD40L of Lymphocytes and Their Cor relation with Tc1 and Tc2Cells in Per ipheral Blood in Asthmatic ChildrenHUANG Hua- rong, LIU Tian- tian, WEI Jing, WU Bao- jing, TAN Wei- ping, MAI Xian- di( Department of Pediatrics, The Second Affiliated Hospital, SUN Yat- sen University, Guangzhou 510120, China )Abstract : 【Objective】 To investigate the expression of CD40/CD40L and their correlation with Tc1/Tc2 cellsof peripheral blood in children with attack asthma. 【Methods】The flow cytometry was used to detect the expressionof CD40/CD40L and change of Tc1 and Tc2 cells of peripheral blood in 30 children with attack asthma and 20normal children. 【Results】The expression levels of CD40 were 21.59±7.61 and 15.82 ±4.44 (t=3.376, P< 0.001),CD40L were 0.20±0.11 and 0.33±0.12 (t=- 2.747, P< 0.05) in asthmatic children and the control, respectively. Thepercentages of Tc1 cells were 9.06±3.80 and 7.28±3.01 (t=0.582, P >0.05), Tc2 cells were 7.64±3.67 and 3.02±1.38 (t=0.582, P< 0.001) in asthmatic children and the control, respectively. There were no significant correlationbetween the expressions of CD40 or CD40L and the percentage of Tc1 or Tc2 cells !. were - 0.004, 0.231, and -0.280, 0.186, respectively; P >0.05). 【Conclusions】Expression of CD40/CD40L and changes of Tc1/Tc2 cells aresignificant abnormal of peripheral blood in children with attack asthma, which can contribute to the immunepathogenesis of asthma.Key words: asthma; CD40/CD40L; cytotoxic T cell; lymphocyte; child[J SUN Yat- sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1): 79- 82]第 28 卷 第 1 期2007 年 1 月Vol.28 No.1Jan. 2007中山大学学报(医学科学版)JOURNAL OF SUN YAT-SEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)DOI:10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2007.0018表 1 哮 喘 患 儿 外 周 血 CD40、CD40L 的 表 达 率 和 Tc1、Tc2细胞数的变化 ( %)Table 1 Expression of CD40, CD40L and change of Tc1, Tc2cells in peripheral blood in asthmatic children (%)Control groupAsthma groupn2030CD4015.82±4.4421.59±7.611)CD40L0.33±0.120.20±0.112)Tc17.28±3.019.06±3.80Tc23.02±1.387.64±3.673)Compared with the normal control group: 1) t=3.376, P<0.001; 2) t=- 2.747, P< 0.05; 3) t=3.981, P< 0.001常、气道反应性增强等。在众多实验中发现 , 发作期哮喘患儿的 T、B 淋巴细胞功能均有不同程度的异常 , 而以 T 细胞功能异常更为关注[1- 3]。在免疫反应的起始阶段 , T 细胞激活需要两个信号 : 主要组织相容性复合物 (major histocompatibility complex,MHC)- 抗原肽信号和共刺激信号 , 如缺乏共刺激分子提供的共刺激信号 , T 细胞便不能活化 , 而处于 无 能 状 态 。 CD (cluster of differentiation) 40/CD40L 是重要的协同刺激分子 , 它们在哮喘中的作用如何 , 以及它们在哮喘免疫发病中与细胞毒性 T 细胞 ( cytotoxic T cell, Tc) 的关系如何鲜见报道。我们应用流式细胞术检测哮喘患儿的外周血淋巴细胞的 CD40、CD40L 表达和 Tc1、Tc2 细胞数的变化 , 并探讨它们的关系 , 以进一步探讨哮喘的发病机制。1 材料与方法1.1 材 料2004 年 3 月~2006 年 3 月 , 初次发作期哮喘患儿 30 例随机进入研究组 , 均为我科住院或哮喘专科门诊的病人 , 均符合我国的儿童哮喘的诊断标准[4], 其中男性 21 例 , 女性 9 例 , 年龄为 3 月~13( 4.68±3.40) 岁 ; 正常对照组为同期的健康 体 检 者20 例 , 无哮喘及过敏性家族史 , 其中男性 13 例 , 女性 7 例 , 年龄为 1.3~12( 4.95±3.20) 岁。两组患儿的年 龄 分 布 ( t=0.224, P=0.824) 及 性 别 构 成 ( !2=0.138, P=0.710) 均无统计学差异。1.2 方 法1.2.1 主 要 试 剂 及 仪 器 鼠 抗 人 CD40 - FITC、CD154( CD40L) - FITC、CD3- TC、CD8- FITC、IFN!-PE、IL4- PE、同型阴性对照鼠抗人 IgG1- PE 和大鼠抗人 IgG1- PE 均购自 BD Pharmingen 公司。流式细胞仪 FACS Calibur, BD 公司产品。1.2.2 CD40、CD40L 的检测 采集空腹肝素静脉抗 凝 血 2 mL, 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 单 个 核 细 胞 ,PBS 洗涤, 将浓度为 1×106/mL 单个核细胞以 100"L 加入试验管和阴性对照管中, 试验管加入荧光标 记 的 单 克 隆 抗 体 CD3- TC+ CD40- FITC、CD3-TC+ CD40L- FITC, 阴性对照管中加入 IgG1- PE,用流式细胞仪进行淋巴细胞上 CD40/CD40L 表达率检测。1.2.3 Tc1、Tc2 的 检 测 取 100 "L 肝 素 抗 凝 血与 100 "L RPMI1640 混匀后 , 加入 5.0 "L PMA( 1"L/mL) 、4 "L Ionomycin ( 50 "L/mL) 、3.4 "lMonensin( 0.1 mg/mL) , 37 ℃、体 积 分 数 5%CO2 培养 4~6 h。吸出 100 "L 培养的全血 , 用做破膜染色QC 用。加入 20 "L CD3- TC 和 20 "L CD8- FITC,室温避光 15 min 后 , 分 成 4 管 ( 编 号 A1、A2、A3、A4) , 每管加入 50 "L 已染色的全血 ; 每管加入100 "L Fix Perm 中的 Regent A 液( 固定液) , 室温避 光 15 min, 加 入 3 mL PBS, 1200 r/min 离 心 5min, 弃去上清 ; 每管中加入 100 "L Fix Perm 中的Regent B 液( 破膜液和溶血液) , 同时各管中 A1 加照鼠抗人 IgG1- PE, A2 加 IFN!- PE, A3 加 大 鼠 抗人 IgG1- PE, A4 加 IL4- PE 各 5 "L; 室温避光 15min, 加入 3 mL PBS, 1 200 r/min 离心 5 min, 弃去上清; 0.5 mL PBS 重悬细胞 , 上机检测。1.3 统计学处理定 量 资 料 应 用 均 数±标 准 差 ( x±s) 表 示 , 两 组均数比较采用独立 t 检验。采用 Pearson 相关系数r 进行相关分析。定性资料应用率或比表示 , 采用!2 检验。所有数据处理均在计算机 SPSS10.0 软件包进行。2 结 果2.1 哮喘患儿外周血 CD40、CD40L 的表达哮喘患儿的外周血淋巴细胞 CD40 表达率明显高于正常对照组 ( t=3.376, P< 0.001) ; 而 CD40L表达率明显低于正常对照组 ( t=- 2.747, P< 0.05;表 1; 图 1- 3) 。2.2 哮喘患儿的外周血 Tc1、Tc2 细胞数的变化哮 喘 患 儿 的 外 周 血 Tc1 细 胞 数 高 于 对 照 组 ,但 无 显 著 性 差 异 ( t=0.582, P >0.05) ; 而 Tc2 细 胞数明显高于对照组 ( t=3.981, P< 0.001) , 差异有统中山大学学报(医学科学版) 第 28 卷80图 1 外周血淋巴细胞分离Fig.1 Lymphocyte separate图 3 CD40L FITCFig.3 CD40L FITC图 2 CD40 FITCFig.2 CD40 FITC2.3 哮 喘 患 儿 外 周 血 CD40、CD40L 的 表 达 与Tc1、Tc2 细胞数的关系CD40、CD40L 的 表 达 率 与 Tc1、Tc2 的 细 胞 数无明显相关性( 表 2) 。3 讨 论初始 T 细胞的完全活化 , 需要两种活化信号分子的协同作用 , 第 1 信号由 T 细胞抗原受体(Tcell antigen receptor, TCR)识别抗原产生 , 经 CD 分子将信号转导至细胞内 , 第 2 信号(或称协同刺激信号) 则由抗原提呈细胞 (antigen presenting cell,APC)或靶细胞的协同刺激分子与 T 细胞表面的相应的协同刺激分子受体相互作用而产生。在协同刺激信号的作用下 , 已活化的抗原特异性 T 细胞增殖、分化为效应 T 细胞。目前已知的协同刺激分子有 B7/CD28 和 CD40/CD40L 等 [5]。已有研究表明 : B7/CD28 在 哮 喘 中 起 重 要 作 用 [6], 但 有 关CD40/CD40L 在 哮 喘 患 儿 免 疫 发 病 机 制 中 的 作 用研究较少 , 且结果不统一。CD40 分布广泛 , 主要表达在 B 细胞、单核 细胞、树突状细胞、成纤维细胞等。CD40L 主要由活化的 T 细胞表达 , 其中在 CD4T 细胞的表达明显高于 CD8T 细胞 , 而 B 细胞、NK 细胞和单核细胞表面也有少量表达。表达于 T 细胞表面的 CD40L通过 CD40 对 B 细胞介导的免疫反应发挥重要的调节作用。如果缺乏刺激信号 , 则 T 细胞不能完全活化 , 而处于无能状态[5,7]。本组资料表明 : 在哮喘发作期患儿外周血淋巴细胞的 CD40 表达明显升高 , 这与国外多项研究的结果一致 [8,10]。但 CD40L 则降低 , 这提示在哮喘发作期 , 哮喘患儿 T 细胞的活化功能或数量是降低的 , B 细胞活化还存在着其它激发途径 , 如 T、B图 5 Tc1 阴性对照Fig.5 Negative control of Tc1图 6 Tc1 FITCFig.6 Tc1 FITC图 7 Tc2 阴性对照Fig.7 Negative control of Tc2图 8 Tc2 FITCFig.8 Tc2 FITC计学意义( 表 1; 图 4~8) 。表 2 哮 喘 患 儿 外 周 血 CD40、CD40L 的 表 达 与 Tc1 和 Tc2细胞的关系Table ! Expressions of CD40 and CD40L were related withTc1 and Tc2 cells in peripheral blood in asthmatic children (%)CD40CD40LTc1Tc2rPrPrPrPCD40- 0.1140.5480.3520.0840.2310.266CD40L- 0.1140.548- 0.2820.1750.1860.373Tc1- 0.0040.985- 0.2820.175- 0.0190.928Tc20.2310.2660.1860.373- 0.0190.928黄花荣 , 等. 哮喘患儿的外周血淋巴细胞 CD40/CD40L 的表达及其与 Tc1 和 Tc2 的关系第 1 期图 4 CD3 淋巴细胞分离Fig.4 CD3 lymphocyteseparate81[1][2]细胞间其它信号分子和细胞因子的刺激 [11]。这些结果提示哮喘患儿存在 CD40/CD40L 刺激信号传导途径的异常 , 有可能参与了哮喘的免疫发病。目前已公认 , 哮喘的发病与 Th (help T cell) 2细胞因子分泌过多有关。具有细胞毒作用的 T 细胞 ( Tc) 同 样 分 为 Tc1 和 Tc2 两 个 亚 群 , 分 泌 细 胞因 子 类 型 与 Th1 细 胞 类 似 的 Tc 细 胞 称 为 Tc1 细胞 , 分泌细胞因子类型与 Th2 细胞类似的 Tc 细胞称为 Tc2 细胞。Tc1 及 Tc2 的细胞数在哮喘发作期有何改变 , 以往研究甚少。本 组 资 料 还 显 示 : Tc2 明 显 升 高 , Tc1 虽 亦 升高 , 但与对照组比较无显著性意义。这提示哮喘患儿 Tc2 细胞在哮喘免疫发 病 中 也 起 关 键 的 作 用 。另外 , 我们在既往研究中发现 , 哮喘患儿外周血IFN- γ水平较正常明显降低 , 发作期更为明显[1,12],而本次实验结果显示分泌 IFN- γ的 Tc1 细胞在哮喘发作期较正常对照增多 , 由此我们推测 , 哮喘患儿发作期可能存在 IFN- γ分泌的障碍 , 从而导致外周血 IFN- γ水平的降低。最近的研究发现 , 细胞 毒 性 T 细 胞 ( Tc) 的 激发可通过激发树突状细胞 ( DC) 的 CD40 分子而绕过 Th 细胞的辅助作用 , 这对激发体内 Tc 提供了新 的 手 段 [13]。 我 们 分 析 CD40/CD40L 的 表 达 与Tc1、Tc2 细胞数的关系 , 结果提示 : 哮喘患儿发作期 CD40、CD40L 表达与 Tc1、Tc2 细胞数均无明显相关性。这些结果提示 CD40、CD40L 表达可能与T 细胞的活化功能有密切的关联 , 而与 T 细胞的数量的多少无明显的关联 , 从而可能从侧面帮助说明在哮喘发病机制中 Th 细胞起着关 键 性 的 作用。最近有研究认为 , CD40 和 CD40 与 CD40L 的相互作用 , 参与了黏膜的防御和保护作用[10,14]。因此 , 在哮喘患儿中 , 可能存在极其复杂的免疫与免疫调节异常 , 需要更广泛、更深入的免疫学的 研 究 。 本 组 资 料 提 示 : CD40/CD40L 的 表 达 和Tc1/Tc2 细胞数的异常 , 可能与哮喘的发生有重要的关联。参考文献:黄 花 荣 , 麦 贤 弟 .哮 喘 患 儿 外 周 血 CD25 与 IFN- γ的水 平 变 化 及 其 相 关 性 研 究 [J]. 中 山 医 科 大 学 学 报 ,2002, 23( 5) : 361- 363.麦 贤 弟 , 赵 莉 , 檀 卫 平 , 等 . 哮 喘 患 儿 IL- 12、IL- 13与 IgE 水平变化[J].中 山 医 科 大 学 学 报 , 2000, 21( 5) :400- 402.MOCHIZUKI H, SHIGETA M, MORIKAWA A.Development of bronchial hyperresponsiveness duringchildhood [J]. J Asthma, 2001, 38(1): 1- 21.中华医学会儿科学分会呼吸组.儿童支气管哮喘防治常规[J].中华儿科杂志 , 2004, 42( 2) : 100- 106.姚 智 . 适 应 性 免 疫 应 答 细 胞 : T 淋 巴 细 胞[M]//陈 慰峰 . 医学免疫学 , 第 4 版 . 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社 ,2004: 100- 109.AGEA E, FORENZA N, PIATTONI S, et al. Expressionof B7 co- stimulatory molecules and CD1a antigen byalveolar macrophages in allergic bronchial asthma [J].Clin Exp Allergy, 1998, 28 (11): 1359- 1367.TAYLOR P A, FRIEDMAN T M, KOMGOLD R, et al.Tolerance induction of alloreactive T cells via ex vivoblockade of the CD40: CD40L costimulatory pathwayresults in the generation of a potent immune regulatorycell [J]. Blood, 2002, 99 (12): 4601- 4609.CAGNONI F, ODDERA S, GIRON- MICHEL J, et al.CD40 on adult human airway epithelial cells:expression and proinflammatory effects [J]. J Immunol,2004, 172(5): 3205- 3214.BURGESS J K, BLAKE A E, BOUSTANY S, et al.CD40 and OX40 ligand are increased on stimulatedasthmatic airway smooth muscle [J]. 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哮喘患儿的外周血淋巴细胞CD40/CD40L的表达及其与Tc1和Tc2的关系

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