摘　要　建立白血病中费城( Ph )染色体上独特的bcr-abl融合基因的逆转录PCR( RT-PCR)快速检测方

法。利用正交设计原理优化逆转录反应条件,探讨该法中引物设计和嵌套式PC R对检测灵敏度的影响, 利用扩

增产物所含限制性酶切位点进行产物特异性鉴定。运用此法检测12例慢性粒细胞白血病,除1例阴性外,其余

11例阳性标本含不同类型( b 3a2, b2a2, B1a2) bcr-abl m RN A。讨论了用于临床标本检测中应考虑的问题

李　巍　杜传书

Directory of Open Access Journals

白血病 BCR-ABL融合基因逆转录 PCR检测中的实验因素探讨①李　巍②　杜传书(中山医科大学医学遗传教研室 ; 广州 , 510089)摘　要　建立白血病中费城 ( Ph )染色体上独特的 bcr-abl融合基因的逆转录 PCR( RT-PCR)快速检测方法。 利用正交设计原理优化逆转录反应条件 ,探讨该法中引物设计和嵌套式 PC R对检测灵敏度的影响 ,利用扩增产物所含限制性酶切位点进行产物特异性鉴定。 运用此法检测 12例慢性粒细胞白血病 ,除 1例阴性外 ,其余11例阳性标本含不同类型 ( b 3a2, b2a2, B1a2) bcr-abl m RN A。 讨论了用于临床标本检测中应考虑的问题。主题词　白血病 /遗传学 ; 融合蛋白质类 , bcr-ab l /分离和提纯 ; 聚合酶链反应中图号　 R 733. 7　　临床上 ,检测费城 ( Ph )染色体可作为慢粒( CM L)和急淋 ( ALL )等白血病分型诊断依据、疗效评价、微小残余病的检测及预后评估的可靠指标。Ph的形成是由于 9和 22号染色体的相互易位引起。 在分子水平上 ,表现为 9号染色体上的 c-abl原癌基因易位到 22号染色体的 bcr区形成 bcr-abl融合基因 ,转录后形成的 bcr-abl m RNA常以 3种形式 ( b3a2, b2a2, B1a2)单独或同时存在 ,其中 b3a2和b2a2主要在 CM L中存在 , B1a2主要在 ALL中出现 [1]。常规 Ph染色体检查需时长、检测灵敏度较低 ,应用逆转录 ( RT ) -PCR法检测 bc r-abl基因以代替传统的 Ph染色体检查 ,更具临床价值。本文探讨了检测 bcr-abl融合基因的 RT-PCR法的有关实验影响因素和临床应用分析。1　材料与方法1. 1　标本采集CM L患者 12例为实验对象 ,健康体检者 4例作阴性对照。 K562细胞株为 b3a2型阳性对照。分别采集 4 mL外周血进行实验。1. 2　 RNA的提取外周血总 RN A的提取按参考文献 [2 ]稍加改良。1. 3　引物序列扩增 bcr-ab1基因的 6种引物序列参照文献 [1] ,见表 1,均在加拿大合成 , PCR扩增产物大小及所含酶切位点见表 2。表 1　 bcr-abl融合基因 RT-PCR引物序列引物名称 外显子部位 　　碱基序列 ( 5′→ 3′)A b2 CTC CAG ACT G TC CAC AGC AT T CCGB B1 CGC A TG TTC CGG G AC AAA AGCC a2 TCA CTG G GT CCA G CG AGA TCD a2 CAG ACC CTG A GG CTC A AA G TC AG AH b2 CAG AAG CTT CTC CCT GA C A TC CCAI a1 CG A TCG TTC GCT TGG CGC A AA表 2　 PCR扩增产物大小及所含酶切位点扩增引物PCR产物大小 ( bp )b3a2 b2a2 B1a2酶切位点b3a2 b2a2AC 218 143 Hinf Ⅰ -BD - - 246 - -IC 200 200 200 PvuⅡ PvuⅡAD 165 90 - Hinf Ⅰ -HC 276 201 - PstⅠ PstⅠHinf Ⅰ , HindⅢ96 中山医科大学学报 ( Acad J SUM S) 1997, 18( 2)∶ 96～ 99美国中华基金会 ( CMB)资助课题 ; ②第一作者 , 1966年出生 ,男 ,博士研究生DOI : 10. 13471 /j . cnki . j . sun. yat -sen. univ (med. sci ) . 1997. 00321. 4　 RT-PCR反应按正交设计原理对 RT反应的条件进行优化(见 2. 2)。 PCR反应参照文献 [1 ]进行。 50μL PC R反应体系中含 RT反应液 10μL,每种引物浓度为25 pmo l, 2 mmo l / L dNT P 5μL , 10× PCR缓冲液5μL, Taq酶 2 U。热循环条件为 94℃ 30 s, 68℃ 90s循环 35次。在嵌套式 PCR中 ,第一次 PCR用 HC引物 ,取扩增产物 1μL进行第二次 PCR,引物用AD,反应条件与第一次相同。取 10μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳后 EB染色鉴定 ,或取 5μLPCR产物于 10%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳后 ,经银染显色鉴定。图 2　 bc r-abl基因 RT-PCR(左 )和嵌套式 RT-PCR(右 )灵敏度试验M 1　 kb Marker, 1 K562细胞 , 2～ 7 K562细胞系列稀释至 1∶ 10～ 1∶ 106, 8正常细胞2　结　果2. 1　 m RNA的完整性及冻存方法的影响m RN A的完整性是检测成功的关键。 由于m RN A易降解 , RNA提取中 ,尽量做到新鲜标本快速低温处理 ,处理中防止 RN A酶的作用 ,处理时间越短越好 ,甚至宁愿牺牲纯度来保证 mRN A的完整性。 本文所用简易细胞总 RNA提取方法全部抽提时间仅需 2 h左右 ,较常规应用的异硫氰酸胍法缩短约 2 h。 经实验验证 ,提取的 RN A用 DEPC-水溶解后于 - 20℃保存至多可用两周 ; 加入 RNasin1 U /μL可用半年以上 ;最好在获得 RN A后即进行逆转录反应 ,以 cDN A形式 - 20℃保存至少可用 1年。2. 2　逆转录反应条件的优化按四因素二水平正交设计原理对 RT反应的 4个主要影响因素 K562细胞总 RNA模板、引物 C、dNTP、 AM V ( Promega公司产品 )在两种不同浓度下进行 A～ H 8组实验 (表 3) ,反应体系含 RNasin( Promega公司产品 ) 40 U ,总反应体积 40μL,反应在 42℃保温 1 h。表 3　 RT反应条件的正交设计试验因　素 A B C D E F G HRN A(μg ) 2. 5 2. 5 2. 5 2. 5 5. 0 5. 0 5. 0 5. 0引物 C( pm ol) 25 25 50 50 25 25 50 50dNT P( m mol /L ) 0. 5 1. 0 0. 5 1. 0 0. 5 1. 0 0. 5 0. 5AMV ( U) 5 10 10 5 10 5 5 10以 PCR扩增产物 EB染色亮度为评价依据。结果表明 H试验的扩增带最亮 , B, C, E组试验中扩增带亮度相对较浅 (图 1)。2. 3　方法的灵敏度将 1μg K562细胞总 RN A用正常人总 RNA按 1∶ 9比例 ,系列稀释至 1∶ 106水平 ,分别用 AC引物进行 RT-PCR(图 2左 )和用 HC, AD引物进行套迭 PCR(图 2右 )。结果表明 ,用 AC引物可检出至1∶ 104稀释水平 ;用 HC引物可检出至 1∶ 105稀释水平 ,再用 AD引物进行嵌套式 PCR,可检出至 1∶106稀释水平。图 1　逆转录反应正交设计试验97第 2期　李　巍 ,等 . 白血病 BCR-ABL融合基因逆转录 PCR检测中的实验因素探讨2. 4　 PCR产物特异性鉴定图 3示经 AC, BD引物两种不同 PCR反应 ,可分 别 得 到 b3a2 ( 218 bp ) , b2a2 ( 143 bp ) , B1a2( 246 bp) 3种不同类型。 若用 AD对引物可扩增出b3a2( 165 bp)和 b2a2( 90 bp)两种片段。 根据 PC R产物所含限制性酶切位点的特性 ,酶切后可对产物特异性进行快速鉴定 ,避免探针杂交鉴定的繁杂操作。 如 b3a2型经 AC引物扩增后出现的 218 bp扩增带中含有一个 Hinf Ⅰ 酶切位点 ,酶切后得到49 bp和 169 bp两条带 (图 3第 2泳道 )。图 3　 bcr-abl基因 RT-PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定　　 M 1 kb Marker, 1 K562细胞 AC扩增带 , 2 AC扩增带 218 bp的 Hin f Ⅰ 酶切 , 3 b 3a2+ b 2a2型 AC扩增带 , 4b2a2型 AC扩增带 , 5 b1a2型 BD扩增带 , 6 b3a2+ b 2a2型AD扩增带 , 7 b 3a2型 AC扩增带2. 5　 CM L病人 bc r-abl基因的 RT-PCR检测结果应用本法检测 12例 CM L的 bcr-abl m RN A的结果 ,除 1例阴性外 (该例为干扰素治疗后 ,用 AC引物作 RT-PCR) ,其余均为阳性 ,阳性率为 91.7%。其中 b3a2型 6例 , b2a2型 3例 , b3a2+ b2a2型1例 , b3a2+ B1a2型 1例。3　讨　论RT-PCR反应成功的关键因素是 m RN A的质量和 RT反应条件 ,从而决定了 PCR模板的可靠性。利用正交设计法对 RT反应条件优化 ,可起到事半功倍的效果。用 HC引物单次 PC R可检测 10 pg RNA水平 ,本室建立的 RNA提取方法得率为 3～ 5 pg /细胞 ,即能检出 2～ 3个恶性细胞。 嵌套式 PCR可进一步提高检测灵敏度和特异性。 灵敏度还与引物设计有关。HC引物灵敏度较 AC引物高 10倍 ,较 Southern分子杂交法 ( 10- 2 )高 1 000倍 ,较 Ph染色体检查( 10- 1 )高 10 000倍 [3 ]。白血病细胞起源于多潜能造血干细胞 ,治疗前体内一般含 1012个白血病细胞 ,治疗后 ,体内白血病细胞数大约 ( 1～ 10)× 1010个 ,此时外周血恶性细胞含量大大超出本实验的最低检出限。有助于微小残余病的检测。因此 ,为简便起见 ,临床标本检测中 ,用 HC引物可不考虑用嵌套式 PCR。高灵敏度实验条件下 ,需特别遵循严格操作以防止因样品间的污染造成的假阳性 [4 ]。 PC R检测阴性 (至少两次不同试验验证 ,同时以最低检出限的阳性标本作对照 ) ,只能说明外周血白血病细胞含量低于该检出限 ,不能排除含极微量白血病细胞的可能。假阴性结果主要与 RN A的质量和 RT反应成败有关 ,这必须用 c-abl m RNA的 IC扩增带作为内对照加以监控。 另外假阴性还来自含非典型拼接方式的bcr-abl m RN A的标本 ,如 c3a2型 [5]。非特异性扩增带有时易与特异带混淆 ,尤其两者长度相近又未经杂交证实时 ,更难在普通琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上区别。我们试用过 AD对引物 (与其它作者 [6]报道的方法所用引物相同 )进行扩增 ,本实验条件下 ,有时在正常人 DNA或 RNA标本中也见一 90 bp左右的非特异扩增带 (已排除样品污染的可能 ) ,在阳性标本中还出现一 75 bp大小的非特异带 (见图 3第 6孔 ) ,这可能与引物的设计和反应条件有关。 因此用于临床标本检测中 ,必须经杂交证实 ,从而限制了其推广应用。但用 AC或 HC引物未见此现象。此外 ,由于总 RNA提取中难免受到少量 DN A的污染 ,因此引物的设计应在不同的外显子上 ,间隔有较长的内含子序列 ,以区分源于 DNA或 m RNA的扩增。据报道 ,约 90%的 CM L具有典型的 Ph染色体 , 5%左右的 CM L有变异型 Ph,其余 5%的 CM L中 ,经 PCR多可检出 bcr-abl(+ )。另约 20%的成人或 5%的小儿 ALL , 1%左右的急粒 ( AM L)也可检出 Ph染色体 [7]。本文结果大致相符。 CM L中 b3a2,b2a2和 B1a2型可同时或单独存在 , Ph (+ ) ALL中除 B1a2型外 ,也可出现 b3a2或 b2a2型。 因此在对CM L或 ALL等的 bcr-abl基因分型中 ,常规应使用两套引物 (如本试验中的 HC和 BD两对引物 )经98 中山医科大学学报 ( Acad J S UMS) 1997, 18( 2)PCR反应来鉴定。本法在 RNA的提取、 PCR的双温循环条件、RT反应条件优化、灵敏度的提高、产物的特异性鉴定等方面作了改进 ,可达到快速检测的目的。该法的灵敏度、特异性和可靠性适用于临床标本的检测。参 考 文 献1　 Kunieda Y, Okabe M , Ku rosawa M, et al . Ch ronicmyeloid leu kemia presenting AL L-type BCR/ ABLtrans crip t. Ann Hematol, 1994, 69∶ 1892　 Gough N M. Rapid and quan titative preparation ofcytoplasmic RN A from small nu mbers of cell s. AnalBiochem, 1988, 173∶ 933　 Roth M S, Antin J H, Bingham E L, et al . Detection ofPhi ladelphia ch rom osome posi tiv e cell s by thepolymeras e chain reaction follow ing bone marrowt ransplant fo r ch ronic myelogenous leuk emia. Blood,1989, 74∶ 8824　 Kw ok S, Hig uchi R. Av oiding fals e posi tives wi thPCR. Natu re, 1989, 339∶ 2375　 Saglio G, Gu erassio A, Rosso C, et al . New type ofbcr /abl junction in Philadelphia ch romosome-posi tiv ech ronic myeloid leuk emia. Blood , 1990, 76∶ 18196　 Dob rovic A, Trainor K J, Morley A A. Detection ofth e molecular abnormality in chronic myelogenou sleukemia b y use of th e polymerase chain reaction.Blood, 1988, 72∶ 20637　 Cross N C P, M elo J V, Lin F, et al . An optimizedmul tiplex polymeras e chain reaction ( PC R ) fordetection of BCR-ABL fusion m RN As inhaematological diso rd ers. Leukemia, 1994, 8( 1)∶ 186( 1996-06-17收稿　 1996-11-15修回 )EXPERIMENTAL STUDY ON THE DETECTION OF BCR-ABLFUSION GENE IN LEUKEMIAS BY RT-PCRLi Wei　　 Du Chuanshu( Departm ent of Medical Genetics, Sun Yat-sen Univ ersi ty of Medical Sciences , Guangzhou , 510089)A rapid reverse tr anscriptase-t ransc ribed PCR ( RT-PC R) was establish ed to de tec t different types( b3a2, b2a2, B1a2) of bc r-abl fusion m RNAs in leukemia s. The RT reaction conditions w ere optimized byo rthogonal design. To improve the sensitivity and specificity , w e used different primers and nested RT-PC Rfo r amplification. The specific PCR products we re identified according to their r estric tion enzyma tic sites withthe use of restriction enzymes in r eplace o f probe h ybridiza tion. U sing these method fo r the detection o f 12cases of ch ronic myeloid leukemia, 11 cases w ere found to be presenting different types o f bcr-abl m RN A.W e a lso pr ovided some considera tions fo r clinical applications.Subject headings　　 leukemia /g enetics; fusion proteins, bcr-abl /isola tion and purification; po lymerasechain reaction99第 2期　李　巍 ,等 . 白血病 BCR-ABL融合基因逆转录 PCR检测中的实验因素探讨

白血病 BCR-ABL 融合基因逆转录 PCR 检测中的实验因素探讨

https://xuebaoyx.sysu.edu.cn/rc-pub/front/front-article/download/43589606/lowqualitypdf/白血病 BCR-ABL 融合基因逆转录 PCR 检测中的实验因素探讨.pdf

白血病 BCR-ABL 融合基因逆转录 PCR 检测中的实验因素探讨

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Directory of Open Access Journals