【目的】构建携 HBx 基因的逆转录病毒载体, 为研究 HBx 基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采 用 PCR 技术从 HBV 全基因组中扩增 HBx 基因; 将 HBx 基因亚克隆至质粒 pLNSX, 构建质粒 pLNSHBx,磷酸钙-DNA 共沉淀 法将重组体导入包装细胞系 PA317, 检测培养上清病毒滴度。【结果】应用 PCR 技术成功地从 HBV 基因组中克隆出全长 HBx 基因, 并经序列分析证实; 建立了产病毒细胞株 PA317/HBx,检测其培养上清病毒滴度为 8. 9×104 CFU, PCR 证实重组 病毒中含有 HBx 基因。【结论】成功构建了携 HBx 基因的较高滴度逆转录病毒载体

刘彦文

闵　军

陈积圣

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携HBx基因逆转录病毒载体的构建　　收稿日期:1999-04-22　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(39700135 ,39970718);国家教委博士点基金资助项目(9750);广东省博士后基金资助项目　　作者简介:闵　军(1965-),男 ,湖北黄石人 ,博士 ,讲师.闵　军1 , 刘彦文2 , 陈积圣1 , 罗树红2 , 余新炳2(中山医科大学　1.孙逸仙纪念医院肝胆外科 , 广东 广州　510120;2.寄生虫学教研室 , 广东 广州　510089)摘　要:【目的】构建携 HBx 基因的逆转录病毒载体 , 为研究 HBx 基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用 PCR技术从 HBV 全基因组中扩增 HBx 基因;将 HBx 基因亚克隆至质粒 pLNSX , 构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙-DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系 PA317 , 检测培养上清病毒滴度。【结果】应用 PCR技术成功地从 HBV 基因组中克隆出全长HBx基因 , 并经序列分析证实;建立了产病毒细胞株 PA317/ HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9×104 CFU , PCR证实重组病毒中含有 HBx 基因。【结论】成功构建了携 HBx 基因的较高滴度逆转录病毒载体。关键词:基因 , HBx;逆转录病毒载体中图分类号:R735.7　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-257X(2000)04S0-0043-03Construction of a Retroviral Vector Containing HBx GeneM IN Jun1 , LIU Yan-wen2 , CHEN Ji-shen1 , LUO Shu-hong2 , YU Xin-bing 2(1.Depar tment of Hepato-biliary Surgery , Memorial Hospital , Sun Yat-sen University of Medical Sciences , Guangzhou 510120 ,China;2.Department of Parasitology , Sun Yet-sen University of Medical Sciences , Guangzhou 510089 , China)Abstract:【Object ive】Establish a ret roviral vector carrying HBx gene for investigation of the effects of HBxgene on the biological behavior of hepatocellular carcinoma.【Methods】HBx gene w as amplified f rom genomicDNA of HBV by PCR technique , and subcloned to plasmid pLNSX to construct recombinant plasmid pLNSH-Bx .Apply ing the calcium phosphate-DNA co-precipitation technique , the pLNSHBx w as transferred intoPA317 packaging cell line.Culture supernatant of these cells w as collected fo r ti tration of the recombinant virus.【Results】HBx gene was cloned from HBV genome by PCR successfully , and proved by sequence determination.A vecto r producing cell line PA317/HBx was established.The titres of the recombinant virus in the culture su-pernatant were 8.9×104CFU.An HBx gene integ ration w as detected by PCR in the recombinant retrovi ralvectors.【Conclusions】A retrovirus vector containing HBx gene was successfully const ructed.Key words:gene , HBx;ret roviral vector　　乙型肝炎病毒(HBV)X 基因(HBx 基因)是HBV 4个开放阅读框中最小的一个 ,编码 154个氨基酸 、分子质量为 17 ku的 X蛋白 ,即 HBxAg 。X蛋白是一种反式激活因子 ,可激活多种细胞基因的启动子 、诱导细胞转化 、失活抑癌基因 P53 、阻止DNA修复等 ,在 HBV诱发肝癌的机制中起重要作用 ,因此 ,被称为“病毒癌基因”[ 1 ～ 3] 。多年来 ,有关HBx 基因研究的焦点主要集中在其诱发肝癌的机制上 ,鉴于 HBx基因转录调节的特点 ,以及肝癌组织中 HBx 基因持续高表达的现象[ 4 , 5] ,我们提出HBx 基因对肝癌的恶性行为具有潜在影响的新观点。为此 ,我们构建了携 HBx 基因的重组逆转录病毒载体 ,为深入研究 HBx 基因对肝癌生物学行为的影响打下基础。现将载体构建过程报告如下 。1　材料与方法1.1　材　料43中山医科大学学报(Acad J SUMS),2000 , 21(4S):43～ 45 , 67DOI :10.13471/j.cnki.j.sun.yat -sen.univ(med.sci).2000.0190携带 3.2 kb 全 长人 HBV 基 因组质 粒pT7T3HBV 、逆转录病毒载体 pLNSX 、PA317包装细胞系和小鼠成纤维细胞系 NIH3T3 均为本室保存;G418 购自 Boehringer Mannheim 公司 , Poly-brene 为 Sigma 公司产品 ,各种限制性内切酶和PCR试剂购自华美生物工程公司 。1.2　HBx基因克隆根据 HBx 基因全序列设计引物 , 5′端引物(X1)为:5′-GG aagcttCATATGGCTGCTAGGCTG-3′;3′端引物(X2)为:5′-TGaagct tAGATCTT-GAACAGTAGGA-3′,引物两端均含 Hind Ⅲ酶切位点 , 扩 增 片 段 长 度 为 518 bp 。 以 质 粒pT7T3HBV为模板 ,PCR反应体积为 100 μL ,其中含2.5 mmol/L 4×dN TP 8 μL , 5′和 3′游引物各100 pmol/L , Taq DNA聚合酶 3 U ,反应条件为 94℃45 s、50 ℃45 s、72 ℃1 min ,35个循环。反应结束后 ,10 g/ L 琼脂糖凝胶电泳 , DEAE 膜回收片段。在全自动序列分析仪中进行序列分析。1.3　HBx基因重组逆转录病毒载体的构建质粒 DNA的提取 、酶切 、片段回收 、去磷酸化 、连接 、转化参照文献[ 6]方法进行。1.4　逆转录病毒的包装重组质粒导入 PA317包装细胞系采用磷酸钙-DNA共沉淀法[ 6] 。1.5　培养上清病毒鉴定分别于转染后 3 、7 、14 、21 d 收集细胞培养上清 ,同时收集筛选后的阳性克隆细胞株培养上清 ,5 000 r/min(Eppendo rf 5417 型离心机 , r =9.2cm)离心 5 min ,取上清煮沸 15 min ,以此为模板 ,分别以 HBx 基因引物 X1 和 X2 ,新霉素抗性基因(neomycin resistance gene ,NeoR)引物 N1 和 N2[ 7]进行 PCR反应 。1.6　病毒滴度测定收集 PA317/HBx 细胞培养上清 , 5 000 r/min离心 5 min ,上清用 0.22 μm 微孔滤膜过滤 ,以 1mL 每管分装 , -70 ℃冻存备用 。在 25 mL 的培养瓶中接种 105 个 N IH3T3细胞 ,置 37 ℃、 φ=5%CO2 培养 24 h , 吸去培养液 , 将病毒上清分别按10-3 、10-4倍稀释 ,以每瓶 1 mL 加入到细胞表面 ,同时加入 8 μg Polybrence ,在 37 ℃、 φ=5%CO2条件下吸附 2.5 h ,再加入 2 mL RPM I 1640 完全培养基培养 24 h ,PBS 洗去病毒 ,换含 G418(终质量浓度400 g/ L)的培养液进行选择培养 ,3 ～ 4 d换液一次 ,4 ～ 6周细胞克隆形成后 ,在倒置显微镜下计算克隆形成数目。按下列公式计算出上清的病毒滴度:病毒滴度(CFU)=克隆数目×稀释倍数×10。2　结　果2.1　HBx基因克隆与序列测定PCR产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳 ,可见一条特异条带位于 DNA 分子 Marker(M)标准 515bp处 ,与预计扩增长度(518 bp)相符(图 1);以HBx 基因 3′端引物对此特异片段在全自动测序仪中反向测序(部分序列见图 2), 证明此片段即为HBx 基因编码序列 。图 1　HBx 基因 PCR扩增Fig.1　HBx gene amplification by PCRM :PCR Marker , 1:pT7T3HBV plasmid DNA as template;2:ddH2O as template图 2　HBx基因部分序列(反义链)Fig.2　Partial nucleotide sequence of HBx gene(anti-sense)2.2　重组逆转录病毒载体的构建与鉴定PCR产物 Hind Ⅲ酶切 , pLNSX质粒 Hin d Ⅲ酶切 ,用 CIP 酶对载体 5′去磷酸化 ,将目的片段与载体 DNA连接 ,产物转化大肠杆菌 ,快速酚法初筛出重组质粒 , 分别进行 HBx 基因 PCR 扩增及Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ单酶切鉴定。重组体 1和 2经44 中山医科大学学报(Acad J SUMS), 2000 , 21(4S)HindⅢ酶切和 HBx 基因均切出约 500 bp片段 ,以引物进行 PCR扩增 ,也都扩增出约 500 bp左右特异条带 ,这表明 HBx 基因已成功连入 pLNSX载体中。pLNSX与HBx 连接可能有两种方式 ,即正向连接和反向连接 。pLNSX 于 2 786 bp 处有一BamH Ⅰ单酶切点 , HBx 基因在距起始密码子 30bp处也有一 BamH Ⅰ单切点。因此 ,重组克隆经BamH Ⅰ单酶切后 ,正向连接者产生 6 265 bp 与382 bp两个片段 ,而反向连接者则产生 5 829 bp和818 bp 两个片段 。对 1 和 2 号重组质粒进行BamH Ⅰ单酶切 ,电泳结果如图 3所示 。1 号重组子为正向连接 ,命名为 pLNSHBx;2号重组子则为反向连接 ,命名为 pLNSHBxAS 。图 3　pLNSHBx 重组质粒 BamHⅠ酶切鉴定Fig.3　Recombinant plasmid pLNSHBx was identified byrestriction endonuclease emzyme BamHⅠ digestedM:PCR Marker , 1:Recombinant plasmid No.1 w as digestedw ith BamHⅠ , 2:Recombinant plasmid No.2 was digested wi th BamHⅠ , 3:Plasimd pLNSX was digested wi th BamHⅠ , 4:λDNA/ HindⅢ+ EcoRⅠ as DNA marker2.3　携 HBx 基因重组逆转录病毒的包装与滴度测定PA 317包装细胞是小鼠成纤维细胞 NIH3T3经 MoMLV转化而成 ,可为逆转录病毒载体提供结构蛋白 。用磷酸钙-DNA 共沉淀法将 pLNSHBx 导入PA317细胞 ,经 400 mg/L G418 筛选 4 周后形成细胞克隆;将细胞转至一新培养瓶中用 800 mg/L G418加压筛选一次 ,此时仅少数细胞死亡 ,表明转染细胞能稳定表达 NeoR基因。此细胞即为能分泌重组逆转录病毒的 PA317产病毒细胞(vecto rproducing cell ,VPC),命名为 PA317/HBx 。2.4　培养上清病毒鉴定用HBx 基因引物与 NeoR基因引物分别对 3 、7 、14 、21 d及 PA317/HBx细胞培养上清进行 PCR扩增 ,均扩增出特异性的 HBx 和 NeoR基因条带 ,表明转染细胞能产生含 HBx 基因的重组逆转录病毒。2.5　病毒滴度测定用 PA317/HBx 细胞上清感染 NIH3T3 细胞 ,并让细胞在含 G418的培养基中生长 ,第 4周时可见克隆形成 ,此时在相差显微镜下统计克隆形成数目 ,稀释倍数为 10-3的培养瓶中有 37 个克隆生长 ,10-4稀释的有 12 个克隆生长 ,取两者的均数 ,得出培养上清的病毒滴度为 8.9×104 CFU 。3　讨　论HBx 基因编码的 X蛋白是一个多功能的转录调节因子 , 可通过蛋白激酶信号途径活化 AP-1 、AP-2和 NF-κB等核因子 ,促进癌基因和细胞因子基因如 c-myc 、IGF-Ⅰ等的表达 ,调节细胞的生长和分化[ 1] 。在肝癌组织中已发现 HBx 基因与 X蛋白的阳性率很高[ 4 ,5] ,但 X蛋白对肝癌细胞的恶性行为有何影响 ,迄今未见报道 。在本研究中 ,我们采用 PCR技术从 HBV 全基因组中获得全长 HBx基因 ,并成功构建了携 HBx 基因 、具有感染能力与较高滴度的的重组逆转录病毒。由于逆转录病毒载体可介导目的基因整合到细胞基因组中 ,因此 ,利用本实验构建的携 HBx 基因重组逆转录病毒来建立 HBx+表型肝癌细胞株 , 可更接近于临床上HBx 基因阳性肝癌的特征 ,从而为深入研究 HBx基因对肝癌细胞生物学行为的影响打下基础 。参考文献:[ 1] Koike K.Hepatitis B virus HBx gene and hepatocar-cinogenesis(review)[ J] .I ntervirology , 1995 , 38(3 ～4):134.[ 2] Koide K , Takada S.Biochemistry and functions of hepti-tis B virus X protein (review)[ J] .Intervirolog y , 1995 ,38(3 ～ 4):89.[ 3] Schaefer S , Gerlich W H.In v itro transfo rmation by hep-atitis B DNA(review)[ J] .Intervirology , 1995 , 38(3 ～4):143.[ 4] 梁小浣 , 汤钊猷 ,张　予 , 等.乙型肝炎病毒 X 基因在肝癌中的表达[ J] .中华微生物杂志 , 1990 , 10(5):341.(下转第 67 页)45第 4S期　闵　军 ,等.携HBx 基因逆转录病毒载体的构建细胞。这些细胞有较大的的胞体和较粗的细胞突起 ,提示它们是视网膜神经节细胞;而 GFAP 阳性的神经胶质细胞较少 ,这与视网膜的组织结构特点是相吻合的。3.1.2　雪旺细胞培养　雪旺细胞是外周神经主要的胶质细胞 ,其典型的细胞形态呈梭形 ,双极 ,细胞核较清楚 ,胞体有发亮的边缘 ,据此可以进行细胞鉴定。S-100是雪旺细胞中的一种钙结合蛋白 ,可作为鉴定雪旺细胞的依据之一。雪旺细胞于接种后 2 h开始贴壁 ,其分裂增殖缓慢 ,体外培养时细胞增倍需要 1周以上[ 2] ,但一些生长因子对其增殖具有较强的刺激作用 ,如将雪旺细胞接种到已有视网膜神经细胞生长的培养瓶 ,此瓶中雪旺细胞的生长较单纯雪旺细胞的培养瓶中的细胞生长要快 ,表明视网膜神经细胞所分泌的神经营养因子对雪旺细胞的增殖具有增强作用;这与在体外单纯加入NGF 能刺激雪旺细胞的增殖的结果是一致的 。3.2　共生培养的雪旺细胞对视网膜神经细胞的影响3.2.1　外周神经外膜对视网膜神经细胞的影响　当把未去神经外膜雪旺细胞与视网膜神经细胞进行共生培养时 ,雪旺细胞对视网膜神经细胞的生长具有抑制破坏作用。这是因为神经外膜中含有磷脂相关的生长抑制因子(MAG)的缘故 ,MAG 对神经细胞的生长具有抑制作用[ 3 , 4]。3.2.2　雪旺细胞对视网膜神经细胞成活及突起生长的影响　共生培养时(同时接种或将视网膜神经细胞接种于已有雪旺细胞生长的培养瓶),雪旺细胞对视网膜神经细胞的突起生长具有促进作用 ,成活时间也较单纯视网膜神经细胞培养组长 。这与雪旺细胞能合成 、分泌多种神经营养因子(神经生长因子 、脑源性神经生长因子 、睫状神经营养因子等),产生细胞外基质(Ⅰ 、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白 ,层粘连蛋白 ,纤维连接蛋白等)及细胞粘附因子来维持神经元的成活 ,诱导 、促进神经系统的再生有关[ 5 ,6] 。3.3　雪旺细胞与视网膜神经细胞融合生长的意义扫描电镜观察的结果表明雪旺细胞与视网膜神经细胞可以以多种方式融合生长 ,表明雪旺细胞所分泌的物质不仅可在视网膜神经细胞的周围发挥作用 ,而且可以直接导入视网膜神经细胞而发挥作用。这对将来临床上用共生性雪旺细胞视网膜移植来促进中枢神经的再生具有重要的意义[ 7] 。参考文献:[ 1] Kikuchi M , Kashii S ,Honda Y , et al .P rotective effectsof methylcobalamin , a vitamin B12 analog , against glu-tamine-induced neuro to xicity in retinal cell culture[ J] .In-vest Ophthalmol Vis Sci , 1997 , 38(5):848.[ 2] 张自杰 , 朱家恺.乳鼠雪旺细胞的培养纯净和形态学研究[ J] .中华显微外科杂志 , 1991 , 14(1):42.[ 3] Maffei L , Carmignoto G , Perry V H , et al .Schw ann cellspromo te the survival of rat retinal ganglion cells after opticnerve section[ J] .Proc Natl Acad Sci USA , 1990 , 87(5):1855.[ 4] Mari D , Kouichiro K.The ro 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13(1):1.(编辑　张敏瑞)67第 4S期　杨智宽 ,等.大鼠雪旺细胞对视网膜神经细胞成活及突起生长的影响

携 HBx 基因逆转录病毒载体的构建

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