【目的】研究实验性糖尿病大鼠肾组织2 型金属蛋白组织抑制物(TIMP2)mRNA 表达的变化及氯沙坦对它的

影响。【方法】纯种雄性Wistar 大鼠分为3 组, 正常对照组(11 只), 糖尿病大鼠无干预组(11 只), 糖尿病大鼠氯沙坦(血管紧

张素Ⅱ1 型受体阻断剂)干预组(9 只)。链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型。饲养18 周后取出肾以RT-PCR 检测TIMP2 mRNA

表达, 电镜检测大鼠肾小球基底膜厚度及系膜基质密度(系膜基质面积/ 系膜面积);收集24 h 尿测定尿白蛋白排泄

(UAE)。【结果】肾组织TIMP2 m RNA 表达糖尿病大鼠无干预组(0.73 ±0.37)显著高于正常对照组(0.32 ±0.19)(P <

0.05), 糖尿病大鼠氯沙坦干预组(0.34 ±0.17)显著低于糖尿病大鼠无干预组(P <0.05)。UAE(2.18 ±1.98)mg/ d、基底膜

厚度(531.6±107.6)nm 及系膜基质密度56±7 , 糖尿病大鼠无干预组显著高于正常对照组(P <0.05);糖尿病大鼠氯沙坦

干预组UAE(0.65 ±0.89)mg/ d、基底膜厚度(316.6 ±33.3)nm 及系膜基质密度35 ±7 均显著低于糖尿病大鼠无干预组(P

<0.05)。【结论】发生糖尿病肾病糖尿病大鼠, 肾组织TIMP2 mRNA 表达明显增加, 氯沙坦干预能延缓糖尿病肾病发生并降

低TIMP2 mRNA 表达, 提示TIMP2 与糖尿病肾病发病可能有一定关系

宛　霞

李劲高

黄湖辉

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　　收稿日期:2002-02-07　　作者简介:宛霞(1965-),女 ,湖北黄梅市人 ,主治医师 ,学士.氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织 TIMP2 mRNA表达的影响宛　霞 , 黄湖辉 , 李劲高(中山大学孙逸仙纪念医院肾内科 , 广东 广州　510120)摘　要:【目的】研究实验性糖尿病大鼠肾组织 2型金属蛋白组织抑制物(T IMP2)mRNA 表达的变化及氯沙坦对它的影响。【方法】纯种雄性Wistar大鼠分为 3 组 ,正常对照组(11 只),糖尿病大鼠无干预组(11 只),糖尿病大鼠氯沙坦(血管紧张素Ⅱ1 型受体阻断剂)干预组(9 只)。链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型。饲养 18 周后取出肾以 RT-PCR检测 TIMP2 mR-NA表达 ,电镜检测大鼠肾小球基底膜厚度及系膜基质密度(系膜基质面积/系膜面积);收集 24 h 尿测定尿白蛋白排泄(UAE)。【结果】肾组织 T IMP2 m RNA表达糖尿病大鼠无干预组(0.73±0.37)显著高于正常对照组(0.32±0.19)(P <0.05),糖尿病大鼠氯沙坦干预组(0.34±0.17)显著低于糖尿病大鼠无干预组(P <0.05)。 UAE(2.18±1.98)mg/ d、基底膜厚度(531.6±107.6)nm 及系膜基质密度 56±7 ,糖尿病大鼠无干预组显著高于正常对照组(P <0.05);糖尿病大鼠氯沙坦干预组 UAE(0.65±0.89)mg/ d、基底膜厚度(316.6±33.3)nm 及系膜基质密度 35±7 均显著低于糖尿病大鼠无干预组(P<0.05)。【结论】发生糖尿病肾病糖尿病大鼠 ,肾组织 T IMP2 mRNA表达明显增加 , 氯沙坦干预能延缓糖尿病肾病发生并降低 T IMP2 mRNA 表达 ,提示 T IMP2 与糖尿病肾病发病可能有一定关系。关键词:糖尿病/并发症;糖尿病肾病/发病机理;氯沙坦/治疗;2 型金属蛋白酶组织抑制物中图分类号:R587.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-257×(2002)03-0190-04The Effect of Losartan on the Expression of Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 in the Diabetic Kidney　WAN Xia , HUANG Hu-hui , LI J in-gao.(Department of Nephrology , Memorial Hospital , S un Yat-sen University ,Guangzhou 510120 , China)Abstract:【Objectives】To investigate the effect of Losar tan , a blocker o f angiotensinⅡ type-1 receptor , on the expression of tis-sue inhibitor of metalloproteinase-2 (T IMP2)mRNA in the diabetic kidneys.【Methods】The male Wistar rats were divided into 3g roups , the controls(n =11), the diabetic rats w ithout any therapy(n =11), and the diabetic rats trea ted with Losartan(n =9).The diabetic model was made by the intraperitoneal injection of streptozo tocin.At the end of the 18th w eek , the kidney s w eretaken out from all the rats to measure the expression of T IMP2 mRNA by RT-PCR , and observe the glomerular basement membranethickening and mesangial matrix density(mesangial area/ mesangial area)by electronic microscope.At the same time , the 24 hours ofurine was collected to measure the levels of the albumin(UAE).【Results】The expression of renal T IMP2 m RNA in the diabetic ratsw ithout any therapy (0.73±0.37)was higher than that in controls (P <0.05), and in the diabetic rats treated with Losartan(0.34±0.17)lower than in the diabetic rats without any therapy(P <0.05).UAE in the diabetic rats without any therapy(2.18mg±1.98 mg)w as higher significantly than that in controls(0.41 mg/ d±0.47 mg/d , P <0.05), and in the diabetic rats treatedw ith Losar tan (0.65 mg/ d±0.89 mg/ d)lower than in the diabetic ra ts without any therapy (P <0.05).The g lomerular base-ment membrane thickening(531.6 nm±107.6 nm)and the mesangial matrix density(56±7)in the diabe tic rats without any ther-apy were higher significantly than tho se in controls(P <0.05), and in the diabetic ra ts treated w ith Losartan(glomerular basementmembrane thickening 316.6 nm±33.3 nm , mesangial matrix density , 35±7)lower than in the diabetic rat without any therapy (P <0.05).【Conclusions】The expression of T IMP2 mRNA is increased significantly in diabetic kidneys.Losartan can prevent thedevelopment o f diabetic nephropathy , also decrease the expression of T IMP2 mRNA in diabetic kidney s.Our data suggest thatT IMP2 may play a role in the development of diabe tic nephropathy.Key words:diabetes mellitus/complication;diabetic nephropathy/ pathogenesis;losartan/ therapy;tissue inhibitor of metallopro-teinase-2 (T IMP2)　　糖尿病肾病是一种肾小球增殖性病变 ,其发病中心环节为肾小球基底膜增厚及系膜基质积聚增加。以前人们认为肾小球基底膜及系膜基质合成增加在糖尿病肾病发病中起重要作用 ,近年来研究显示他们的降解减少也可能起重要作用[ 1] 。基质金属蛋白酶(matrix metallopro teinase , MMP)是一类降解肾小球基底膜及系膜基质的重要蛋白酶[ 2] 。金属蛋白酶的组织抑制物(tissue inhibitor of metal-loproteinase , TIM P)是 MMP 的天然抑制剂 ,它可通过抑制 MMP 活性而降低肾小球基底膜及系膜基质190 中山医科大学学报(Acad J SUMS), 2002 , 23(3):190～ 193DOI :10.13471/j.cnki.j.sun.yat -sen.univ(med.sci).2002.0063的降解 ,可能与糖尿病肾病发病有关 ,因此我们研究TIMP2 mRNA在实验性糖尿病大鼠肾组织表达的变化 ,并探讨血管紧张素 Ⅱ1型受体(AT1R)阻断剂———氯沙坦干预治疗对其有无影响 。1　材料与方法1.1　实验性糖尿病大鼠模型的制备48只 200 ～ 260 g 的纯种雄性Wistar 大鼠(为同一批繁殖)分为 3组:正常对照组(12只);糖尿病大鼠无干预组(17只);糖尿病大鼠氯沙坦干预组(19只),按氯沙坦 20 mg/kg 每日 1次灌喂 。糖尿病模型制备用链脲佐菌素(STZ , Sigma 公司)溶于枸橼酸缓冲液(0.1 mmol/L ,pH 4.5),按 60 mg/kg腹腔注射 ,空腹血糖维持在 13.9 mmol/L 以上则模型制备成功。实验期间每周检测空腹尾血血糖 1次。糖尿病大鼠饲养期间根据血糖情况给予中效人基因重组胰岛素(Lilly 公司)4 ～ 8 U/d早晨 1次皮下注射 ,维持空腹血糖在 16.7 ～ 26.0 mmol/L 。每间隔 10 ～ 20 d测量 1次体质量和尿量 。1.2　标本的收集与处理模型制成 18周后乙醚麻醉大鼠后取出双肾 ,以4 ℃冷生理盐水洗净 ,小心剥去肾包膜 。取少量肾皮质作电镜切片 。处死大鼠前先收集 24 h尿 , -40℃保存待作尿白蛋白及肌酐检测 ,并于处死大鼠时心脏内取血作肌酐测定。1.3　TIMP2 mRNA表达的检测采用 RT-PCR法 ,以 β-actin作内对照。 β-actin的上游引物为 5′-AGGCCAACC GCGAGAAGAT-GAC-3′, 下游 引物 为 5′-GTACATGGTGGTGC-CGCCAGAC-3′,扩增产物为 581 bp。1.3.1　总 RNA提取　用 Qiagen公司的总 RNA提取试剂盒(RNeasy Midi kit),按说明书进行操作 。1.3.2　RT-PCR　从Genbank 查出大鼠 TIMP2的cDNA 序列 ,在因特网上设计 PCR引物。TIM P2的上游引物为 5′-GGCAAGATGCACATTACC-3′,下游引物为 5′-TTGACATCCCTTCCTGGA-3′, 扩增产物为 386 bp。逆转录(RT):20 μL 反应混合物中含总 RNA 1μg ,逆转录缓冲液 4 μL , dNTP(各 10 mmol/L)2μL , oligo(dT)15 0.5μg ,AMV 2.5 U(Gibco),加灭菌纯水至 20μL 体积 。反应混合物 42 ℃反应 60 min ,然后 99 ℃反应 5 min以灭活 AMV ,产物作 PCR。PCR:50μL反应混合物中含 , RT 产物 10 μL ,10×PCR 缓冲液(不含 Mg2+)5 μL , dN TP(各 10mmol/L)2μL ,MgCl2 2.4μL , β-actin引物(含上 、下游引物各 25 pmol/L)2.0 μL , TIMP-2 引物(含上 、下游引物各 25 pmol/L)2.0 μL , Taq 酶(Gibco)1U ,加灭菌纯水至 50 μL 体积 , 置 Biometra 公司TGRADIENT热循环仪中进行反应。反应参数:95 ℃变性 55 s ,55 ℃退火 56 s ,72 ℃延伸 60 s ,共 36个循环 ,第一循环开始前 95 ℃预变性 7 min ,最后一个循环结束后 72 ℃延伸 10 min。PCR产物的定量:PCR 产物 10 μL 置 20 g/L琼脂糖(含 50 mL/L 溴乙锭)电泳 ,对电泳带进行密度扫描 ,以 TIMP2/ β-actin比值代表 TIMP2 mRNA的表达量 。1.4　肾小球超微结构观察透射电镜下观察肾小球超微结构 。肾小球基底膜厚度以 5条以上的基底膜厚度的平均值表示 ,以系膜基质密度(系膜基质面积/系膜面积)来表示系膜基质含量。用立体计量法测量肾小球基底膜厚度及系膜基质密度[ 3] 。1.5　24 h尿白蛋白排泄(UAE)检测以大鼠白蛋白酶免疫分析试剂盒(SPIbio ,France)测定大鼠尿白蛋白 ,操作按说明书进行 。1.6　肌酐清除率(Ccr)根据血及 24 h 尿肌酐水平计算 Ccr。1.7　统计学方法单因素方差分析 ,非正态分布资料经正态转换后再进行统计处理 ,显著性水准 α=0.05。2　结　果2.1　DM大鼠模型的制备正常对照组大鼠饲养中有 1只死亡 ,为大鼠间互相撕咬所致 , 18 周后余下 11只 。糖尿病无干预组大鼠有 2 只糖尿病模型未制备成功而放弃;1 只中途血糖自然缓解;3只中途死亡 ,其中 1只为大鼠间互相撕咬所致 , 1只为全身衰竭所致 ,另一只死因不明确 , 18周后余下 11只 。氯沙坦干预组大鼠有 4只糖尿病模型未制备成功而放弃;2只中途血糖自然缓解而放弃;4只中途死亡 ,其中 3只为全身衰竭所致 ,1只死因不明(可能为低血糖所致),18周后余下 9只。糖尿病无干预组及氯沙坦干预组大鼠的空腹血糖均在 13.9 mmol/L 以上 ,显著高于正常对照组大鼠 ,糖尿病无干预组与氯沙坦干预组比较无显著性191第 3期　宛　霞 ,等.氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织 TIMP2 mRNA 表达的影响差异 。糖尿病无干预组及氯沙坦干预组大鼠的尿量显著多于正常对照组。3 组大鼠体质量均有所增加 ,但在糖尿病无干预组及氯沙坦干预组的增加幅度(指饲养结束时的大鼠体质量减去开始饲养时的大鼠体质量)显著低于正常对照组(表 1)。结果显示糖尿病模型制备成功。表 1　糖尿病大鼠模型的有关资料Table 1　General data on the model o f diabetic ratsnMass(g)Urinal volume(mL/ 24 h)Blood glucose(mmol/ L)Control 11 161.81±20.42 8.14±1.75 4.74±0.62Diabetes withou t therapy1)11 56.81±8.29 54.59±14.84 23.46±1.39Diabetes treated with Losartan2)9 54.33±10.21 50.83±12.03 23.85±1.34F 196.66 59.03 723.67P <0.01 <0.01 <0.01　　Note:1)vscont rol , P <0.05;2)vsdiabetes wi thout therapy , P>0.12.2　RT-PCR产物每 1 份标本均能特异性地扩增出清晰的TIMP2及 β-actin(图 1)。图 1　TIMP2 mRNA 的 RT-PCR产物电泳图Fig.1　Electrophoresis of the RT-PCR productionof TIMP2 mRNA1:DNA Marker , ΥX174 HincⅡ digest;2:the diabetic rats withouttherapy;3:the normal rats;4:the diabet ic rat s t reated with losartan2.3　TIMP2 mRNA表达　　肾组织 TIM P2 mRNA 表达糖尿病无干预组大鼠组显著高于正常组及氯沙坦干预组 ,氯沙坦干预组与正常对照组比较无显著性差异(表 2)。2.4　肾小球超微结构在各观察组间比较电镜见肾小球基底膜厚度 、系膜面积 、系膜基质密度糖尿病无干预组大鼠均显著高于正常对照组 ,氯沙坦干预组与正常对照组比较差异无显著性(表2)。肾小球基底膜厚度糖尿病无干预组大鼠呈明显的局灶性增生 ,而在正常对照组及氯沙坦干预组大鼠则未见此种现象(图 2 ～ 4)。图 2　正常大鼠的肾小球基底膜Fig.2　The glomerular basement membrane in normal rats(electronic microscope ×30 000)2.5　UAE和 Ccr的变化UAE糖尿病无干预组大鼠显著高于正常对照组及氯沙坦干预组 ,氯沙坦干预组与正常对照组比较差异无显著性(表 2)。Ccr 糖尿病无干预组大鼠显著低于正常对照组 ,氯沙坦干预组大鼠显著高于糖尿病无干预组但显著低于正常对照组(表 2)。3　讨　论近年的研究显示高血糖可导致多种 MMP 在肾组织(或肾小球系膜细胞)的表达发生改变 。在S TZ诱导的糖尿病大鼠 ,发现伴有系膜增殖的糖尿病大表 2　T IMP2 mRNA 表达及 DN 有关指标Table 2　Comparison of the T IMP2 mRNA among different groups ( x ± s)TIMP2　　GBM　　(nm)　　MM area　(μm2)　MM density　(μm2/μm2)　UAE　 　(mg/ d)　 　C cr　 　(mL/ d)　 　Cont rol 0.32±0.19(11) 312.4±25.4(8) 1202±122(8) 33±5(8) 0.41±0.47(11) 59.63±22.75(11)Diabetes w ithou t therapy1)0.73±0.37(11) 531.6±107.6(8) 1924±325(8) 56±7(8) 2.18±1.98(11) 19.75±9.60(11)Diabetes treated w ith Losartan2)0.34±0.17(9) 316.6±33.3(8) 1276±217(8) 35±7(8) 0.65±0.89(9) 40.88±25.57(9)3)F 7.91 28.27 22.62 32.14 5.35 10.82P <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 <0.05 <0.01　　Note:GBM , the glomerular basement membrane;MM , the mesangial mat rix;()the number of rat;1)vs control , P <0.05;2)vs diabetesw ithout therapy , P <0.05;vs control , P >0.1;3)vs control , P <0.05192 中山医科大学学报(Acad J SUMS), 2002 , 23(3)图 3　糖尿病大鼠无干预组的肾小球基底膜Fig.3　The glomerular basement membrane in diabetic ratswithout therapy　(electronic microscope ×30 000)图 4　糖尿病大鼠氯沙坦干预组的肾小球基底膜Fig.4　The glomerular basement membrane in diabetic ratstreated with Losartan　(electronic microscope ×30 000)鼠的肾小球 MMPs表达降低 ,而无系膜增殖的糖尿病大鼠的肾小球 MMPs表达则无变化。在糖尿病NOD 小鼠发现 ,系膜细胞 MMP2 表达下降[ 4] ,在 2型糖尿病病人的肾小球也发现同样的结果[ 5] 。多数研究显示多种 MMP 在高葡萄糖状态下的肾组织(或系膜细胞)表达或活性降低 ,提示 MMP 可能与糖尿病肾病发病有关 。TIMP 是 MMP 的天然抑制物 , 通过抑制MMP 活性而降低细胞基质的降解 ,因此也有可能参与糖尿病肾病发病 。体外研究显示 ,高葡萄糖培养的系膜细胞 T IM P1 表达增加[ 4] 。在 STZ 诱导的糖尿病大鼠肾小球 TIM P1 表达增加[ 6]。关于TIMP2 ,研究结果不一致。McLennan[ 7]等研究发现高葡萄糖培养系膜细胞 , TIMP2 表达无变化。其它研究显示高葡萄糖培养能抑制系膜细胞表达TIMP2 。Caenazzo[ 8]等人发现 ,在高葡萄糖培养的系膜细胞 , MMP2/TIMP2 比值下降 ,即 TIMP2 相对增加 ,这一变化能被肝素处理所逆转。本研究显示 ,在发生糖尿病肾病的糖尿病大鼠肾脏 TIM P2表达增加 , TIMP2增加则通过抑制 MMP2及其它一些 MMPs而降低系膜外基质蛋白降解。本研究还发现 ,氯沙坦治疗不但可延缓糖尿病肾病 ,还可降低糖尿病大鼠肾组织 TIM P2表达 。因此 ,本研究在发生糖尿病肾病的肾组织 TIM P2 表达增加 ,而应用氯沙坦延缓糖尿病肾病发病时糖尿病肾组织 TIMP2表达又明显下降 ,结果提示 TIMP2可能与糖尿病肾病发病有关 ,氯沙坦可能部分地是通过抑制 TIM P2表达而延缓糖尿病肾病发病 。氯沙坦治疗降低 DM 大鼠肾组织 T IM P2 mR-NA表达的机制尚不清楚 。有文献报道血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)可导致肾组织 TGFβ1 表达增加 ,TGFβ1可调节多种 MMP 的表达[ 9];AngⅡ还可上调纤溶酶原激活抑制物(PAI)从而抑制纤溶酶原激活 , 而纤溶酶也可调节某些 MMP 活性或表达[ 10] 。因此 Ang Ⅱ可通过 TGFβ1 及 PAI 而调节多种 MMP 活性或表达。但是关于 Ang Ⅱ与TIMP2 的关系尚未见文献报道 ,其影响机制也不明确 ,而且氯沙坦的作用是直接作用还是由于降低血压而引起的也不清楚 ,尚有待于进一步研究 。参考文献:[ 1] MecLenan S V , Fisher E J , Yue D K , et al.High glucose con-cent rat ion causes a decrease in mesangium degradation[ J] .Dia-betes , 1994 , 43(8):1041.[ 2] Davis M , Martin J , Thomas G J , et al.Proteinase and glomeru-lar mat rix turnover[ J] .Kidney Int , 1992 , 41(3):671.[ 3] 朱　丹 ,余斌杰 ,秦婉文 , 等.立体计量法对链脲佐菌素糖尿病大鼠肾小球毛细血管基底膜和系膜基质改变的初步观察[ J] .中山医科大学学报 , 1990 , 11(3):38.[ 4] Lupia E , Elliot S J , Lenz O , et al.IGF1 decrease collagendegradat ion in diabet ic NOD mesangial cells[ J] .Diabetes , 1999 ,48(8):1638.[ 5] Del Prete D , Angliani F , Forino M , et al.Dow n regulation ofglomerular mat rix metallo-proteinase-2 in human NIDDM [ J] .Diabetologia , 1997 , 40(12):1449.[ 6] Shank land S J , Ly H , Thai K , et al.Glomerular expression ofti ssue inhibitor of metallop rotein-ase(TIMP-1)in normal diabeticrat s[ J] .J Am Soc Nephrol , 1996 , 7(1):97.[ 7] McLenan S V , M artell S Y K , Yue D K , et a l.High glucoseconcent rat ion inhibi ts the memb rane metalloproteinase by mesan-gial cells:possible rol in mesangial accumulation[ J] .Diabetolo-gia , 2000 , 43(5):642.[ 8] Caenazzo C , Garbisa S , Onisto M , et al.Ef fects of glucose andheparin on mesangial alpha 1(Ⅳ)collagen and MM P-2/ TIMP-2mRNA expression[ J] .Nephrol Dial Transplant ,1997 ,12(3):443.[ 9] Bariscosv W H , Cortez S L , Deboisblanc M , et a l.T ransforminggrow th factor-beta is a potent inhibi tor of ext racellular mat rixdegradat ion by cultured human mesangial cells[ J] . J Am SocNephrol , 1999 , 10(4):790.[ 10] Kagami S , Ku roda T , Okada K , et al.Dual effects of an-giotensin on the plasminogen/ plasmin system in rat mesangialcells[ J] .Kidney Int , 1997 , 51(3):664.(编辑　黄小延)193第 3期　宛　霞 ,等.氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织 TIMP2 mRNA 表达的影响

氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织TIMP2 mRNA 表达的影响

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